Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць: 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 4 тез в матеріалах наукових конференцій і з’їздів, 1 методичні рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 174 сторінках машинопису та містить 30 таблиць, 32 рисунки (з них 27 мікрофотографій). Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження, моделювання гіпергомоцистеїнемії», 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який включає 270 джерелo, у тому числі 211 зарубіжних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Предметом експериментального дослідження був новий вітамінно-мікроелементний комплекс, розроблений сумісно співробітниками Інституту фармакології та токсикології АМН України та ВНМУ ім. М.І. Пирогова, який містить суміш координаційних сполук цинку, хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL), ванадат амонію та специфічні для лікування гіпергомоцистеїнемії вітаміни: В6 – піридоксин, В9 – фолієва кислота , В12 – ціанокобаламін. Один грам суміші містить: ZnL2·2H2O – 127 мг (Zn2+ – 14 мг), CrL3·2H2O – 1,64 мг (Cr3+ – 105 мкг), (NH4)3 VO3 – 38 мкг (V5+ – 13 мкг), В6 – 10 мг, В9 – 2 мг, В12 – 0,2 мг та допоміжні речовини.
Вибір цих мікроелементів зумовлений тим, що ферменти метилювання гомоцистеїну (метіонінсинтетаза та бетаїнгомоцистеїнтрансфераза) є Zn-залежними металоензимами [C.W.Goulding et al., 1997; N.S.Millian et al., 1998; J.L.Ferrer et al., 2004; S.Ratnam et al., 2006], а більшість мікроелементів, у тому числі ванадій та хром, є незалежними чинниками нормального функціонування серцево-судинної системи [А.В.Кудрин, О.А.Громова, 2006]. Вважають, що вітамінно-мінеральні комплекси виявляють високу біологічну та лікувальну активність, при включені до них легкозасвоюваних форм мінеральних солей [Г.С. Григор’єва та співавт., 2004]. В зв’язку з цим, до складу ВМК включені сполуки цих мікроелементів. Для порівняння використані два препарати, близькі до ВМК по вітамінному складу. Першим препаратом порівняння (ПП-1) слугувала композиція, описана в роботі R.Clark (1998), яка в клінічних умовах у порівнянні з 19 іншими комбінаціями вітамінів В6, В9, В12 виявляє найвищий гіпогомоцистеїнемічний ефект. Ця композиція включає високі добові дози вітамінів В6, В9, В12 – 10,0; 1,0; 0,4 мг, відповідно, і забезпечує зниження рівня ГЦ в крові пацієнтів з ГГЦ майже на 60%. В якості іншого препарату порівняння (ПП-2) використано відомий в Україні полівітамінний комплекс “Декамевіт” – єдиний з полівітамінних препаратів, що містить в одній таблетці високі дози вітамінів В6, В9, В12 – 20,0; 2,0; 0,1 мг, відповідно.
ВМК та препарати порівняння в тривалих дослідах (10-20 діб) вводили тваринам з дієтою, в короткочасних дослідах – за допомогою зонду в шлунок. Добове дозування ВМК та препаратів порівняння: тваринам на 1 кг маси тіла вводили дози, що в 5 разів перевищують передбачені для людини. Так, у випадку ВМК щури в якості добової дози вітамінів В6, В9, В12 отримували 715; 143; 14,3 мкг/кг маси тіла, та мікроелементів: Zn2+ – 1 мг/кг, Cr3+ – 7,5 мкг/кг, V5+ – 0,93 мкг/кг, в той час як для людини пропонована добова доза цих компонентів в складі ВМК – 143; 28,6; 2,86 мкг/кг та 0,2 мг/кг; 1,5 мкг/кг; 0,186 мкг/кг, відповідно.
Тварини та дієти. Експериментальні дослідження проведені на 377 статевозрілих білих щурах-самцях з масою тіла 200±30 г. Тварин утримували на напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті з контрольованим вмістом всіх нутрієнтів, яку модифікували в залежності від мети експерименту.
Моделі ГГЦ. Використані три моделі гіпергомоцистеїнемії – гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова (ГМГ). Вказані моделі дозволяли підвищити рівень ГЦ в плазмі крові експериментальних тварин: за гострої ГГЦ ~ в 5 разів, за хронічної ГГЦ – в 1,5-2 рази, за ГМГ – в 11-13 разів.
Біохімічні, мікробіологічні та гематологічні дослідження. Досліджували кров, плазму або сироватку крові, гомогенати печінки та нирок. Вміст ГЦ в плазмі крові визначали на апараті Hewlett Packard (США) з використанням колонки Hypersil BDS C-18 методом високоефективної рідинної хроматографії в модифікації [О.О. Пентюк та співавт., 2001]. Рівень білка визначали уніфікованим біуретовим методом [В.В. Меньшиков, 1987], середні молекули (СМ), як показник ендотоксикозу, методом [Н.И. Габриэлян, В.И. Липатова, 1984], малоновий діальдегід (МДА) – за допомогою тіобарбітурової кислоти [В.Н. Орехович, 1977], гідроперекиси (ГП) методом [В.Б. Гаврилов, М.И. Мишкорудная, 1983], карбонільні групи (КГ) білків реакцією з фенілгідразином [H. Refsgaard, 2000]. Визначали забезпеченість тварин, що перебували на гіповітамінозно-метіоніновій дієті, вітамінами – фолієвою кислотою (прямим методом) та вітамінами В6 і В12 (непрямими методами). Вміст фолату в плазмі крові визначали мікробіологічним методом за допомогою фолатдефіцитного штаму Lactobacillus casei АТСС 7469 [Ю.М. Островский, 1979], статус вітаміну В6 – по активності в печінці ферментів АСТ та АЛТ [В.В. Меньшиков, 1987], вітаміну В12 – по екскреції з сечею метилмалонової кислоти [Л.В.Снегирева, 1972]. Вміст гемоглобіну визначали за допомогою геміглобінціанідного методу, кількість еритроцитів та лейкоцитів – в камері Горяєва. Ці дослідження виконані в акредитованій для біохімічних досліджень науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім.М.І.Пирогова (завідувач лабораторією професор О.О. Пентюк).
Морфологічні дослідження. Протягом експерименту визначали мікроскопічну будову внутрішніх органів шляхом зафарблення зрізів тканин гематоксиліном та еозином і гістохімічними методами [Н.З. Слінченко, 1964], Picro-Mallory V [Д.Д.Зербино, Л.Л. Лукасевич, 1989] для виявлення наявності в судинах фібрину та його “віку”.
Статистичні методи. Отримані цифрові дані підлягали обробці за допомогою методів варіаційного аналізу з використанням пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows 98. Підраховували середні значення критеріїв, а також середньоквадратичні відхилення (М±m). Використовували також універсальні статистичні пакети до персонального комп’ютера “Exсel”. Для визначення зв’язків між показниками використовували кореляційний аналіз (з вираховуванням r) по Пірсону [Е.В.Гублер, 1978]. Достовірною вважалась різниця за Р≤0,05.
Результати досліджень та їх обговорення. Виявлено, що протягом експериментів, проведених на трьох моделях ГГЦ, у тому числі на гіповітамінозно-метіоніновій, використані дієти забезпечують нормальний приріст маси тіла тварин всіх груп, крім того щури візуально мають звичайний вигляд та поведінку. Відсутність негативного впливу на масу тварин гіповітамінозно-метіонінової дієти пояснюється тим, що в дослід були взяті дорослі, а не молоді тварини та відносно невеликою (14 діб) тривалістю дослідів. Характерно, що ВМК та препарати порівняння не справляли помітної негативної дії на загальний стан тварин, а також не виявили здатності гальмувати чи стимулювати їх ріст.
1. Дослідження на моделі гострої метіонінової ГГЦ
На цій моделі вивчена профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння. Суть моделі полягає в тому, що тваринам одноразово, зондом в шлунок вводять велику кількість L-метіоніну - по 1 мл 5 % розчину на 100 г маси тіла. При цьому через 2 години рівень ГЦ в плазмі крові досягає максимуму. Профілактика полягала в попередньому протягом 10 діб введенні щурам через рот за допомогою зонду ВМК або препаратів порівняння, утриманні на дієті збагаченій ВМК. Отримані дані наведені в табл. 1.
Таблиця 1
Порівняльна профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння (ПП-1 та ПП-2) на моделі гострої метіонінової ГГЦ (М±m)
| № груп | Умови досліду | n | Рівень ГЦ, мкг/мл | Зниження у порівнянні з групою 2, % |
| 1 | Інтактний контроль | 10 | 1,63±0,28 | - |
| 2 | Гостра метіонінова ГГЦ (контроль ГГЦ) | 10 | 8,26±1,53* | - |
| 3 | ГГЦ + попереднє введення ВМК | 11 | 2,86±0,26* | - 65,4 % |
| 4 | ГГЦ +попереднє введення ПП-1 | 9 | 3,50±0,59* | - 57,6 % |
| 5 | ГГЦ +попереднє введення ПП-2 | 10 | 3,88±0,32*# | - 53,0 % |
| 6 | ГГЦ + попереднє утримання на дієті, збагаченій ВМК | 10 | 2,75±0,22 | - 66,7 % |
Примітки:
1. * - Р≤0,05 у порівнянні з інтактним контролем;
2. # - Р≤0,05 у порівнянні з дією ВМК (група 3).
Виявлено, що попереднє введення тваринам ВМК та препаратів порівняння достовірно знизило гіпергомоцистеїнемічну дію L-метіоніну. Ефективність ВМК та ПП-1 була рівною і вищою, у порівнянні з ПП-2. Характерно, що введення ВМК за допомогою зонду або з дієтою в умовах гострої ГГЦ було однаково ефективним (зниження рівня ГЦ на 65,4 та 66,7 %, відповідно).
2. Дослідження на моделі хронічної метіонінової ГГЦ
Суть цієї моделі ГГЦ полягає в згодовуванні тваринам протягом 14 діб дієти, збагаченої L-метіоніном (1 % до сухої маси). Профілактика полягала у тому, що тварини певних груп отримували дієту, збагачену не тільки L-метіоніном, але і ВМК або препаратами порівняння. Лікування ГГЦ та ускладнень, індукованих ГГЦ, здійснювали шляхом щодобового введення тваринам з ГГЦ в шлунок зондом протягом 3 діб ВМК або препаратів порівняння. Отримані дані наведені в табл. 2.
Таблиця 2
Порівняльна профілактична та лікувальна дія ВМК, ПП-1 та ПП-2 на динаміку біохімічних показників крові щурів на моделі хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії (М±m)
| № груп | Умови досліду | Рівень ГЦ в плазмі крові, мкг/мл | Сироватка крові | Середні молекули, екстинція | ||
| білок,г/л | малоновий діальдегід, мкмоль/л | кетогрупи білків, мкг/100мг білка | ||||
| 1 | Контроль, інтактні тварини | 1,65±0,21 | 63,9±4,1 | 13,30±0,72 | 44,9± 2,4 | 205,0±10,2 |
| 2 | Контроль ГГЦ | 3,70±0,30* | 66,4±4,7 | 17,80± 0,95* | 60,3±2,5* | 215,0±12,8 |
| Профілактична дія - харчування метіоніновою дієтою, збагаченою: | ||||||
| 3 | ВМК | 1,87±0,23# | 61,9±4,2 | 13,20± 0,88# | 42,8±2,0# | 211,0±9,5 |
| 4 | ПП-1 | 1,92±0,25# | 65,5±4,8 | 15,90 ±0,74* | 55,3±2,6* | 213,0±13,7 |
| 5 | ПП-2 | 2,78±0,23* | 63,7±4,0 | 13,10± 1,07# | 48,8±2,0# | 208,0±10,9 |
| Лікувальна дія – введення тваринам в шлунок протягом 3-х діб після моделювання ГГЦ: | ||||||
| 6 | ВМК | 1,44±0,19 | 67,7±4,8 | 14,20±0,83# | 50,5±2,5# | 216,0±13,6 |
| 7 | ПП-1 | 1,54±0,20 | 65,8±4,1 | 14.60±1.05# | 57,2±2,4* | 214,0±10,5 |
| 8 | ПП-2 | 2,02±0,21 | 63,9±3,9 | 13,40±1,08# | 50,2±1,9# | 210,0±8,8 |
Примітки: