Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин).
Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой - по Граму.
Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды.
Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков-отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.
При постановке реакции агглютинации (РА) используют полистироловые пластины или большие стекла. Для каждой испытуемой культуры менингококков используют один ряд лунок пластины. Число горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки + одна капля взвеси культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых культур. Для этого запаянной изогнутой пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают с чашки Петри и тщательно эмульгируют в физиологическом растворе. Для получения оптимальной рабочей густоты к взвеси добавляют по 1,0 мл физиологического раствора. Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки.
Пластины встряхивают в течение 1 мин. руками или шуттеле-аппарате. Учитывают реакцию в течение первых 3-х минут. Контролем служит лунка, в которой готовят исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.
В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 * 12 см наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1% агара на физиологическом растворе. В застывшем агаре с помощью металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см. Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические - прогретые при +1000С в течение 15 минут взвеси испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение 2-х недель. Для реакции микропреципитации используют не разведенные сыворотки.
Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка, выращенной на 20% сывороточном агаре, должна составлять 30 - 60 единиц, т.е. быть в 3 - 6 раз гуще оптического стандарта мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) на 24 - 48 часов при +20 - +220С. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде линии преципитации.
У больного гнойным менингитом, желательно до применения химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого используют аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или другой любой марки. В аппарат заливают "камерный" веронал-мединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 веронала (веронал надо греть на водяной бане до полного его растворения) рН = 8,6. Приготовленный 1% агар, растопленный и остуженный до +600С, наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки, размером 9 * 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстий на расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.
Антисыворотки вносят в лунки, расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в лунки со стороны катода (-).
Сыворотку вносят в отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы А или С с гомологичной сывороткой, в концентрации 10 - 20 мкг/мл. Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 20 - 30 мин. при силе тока 12 - 15 МА на 1 стекле. Аппарат работает при комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин. после выключения тока, между лунками (с одной из сывороток и ликвором) появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для ускорения этого процесса в тот же день, можно 2 - 3 раза пропускать ток через пластинку в течение 5 - 10 мин, т.е. время анализа увеличивается до 60 мин.
РНГА с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:
а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).
б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;
в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;
г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.
РНГА можно ставить как макро-, так и микрометодом, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".
Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.
Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре.
При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.
Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.
После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирку, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +40С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.
Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.
Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе.
За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее, чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+.
Сыворотки крови с разведения 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.
При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму, тяжесть и период болезни; сопутствующие заболевания, серологические особенности возбудителя. При менингококковой инфекции, так же как и при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов серологических исследований может быть дана только при их сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.
Оптимальные сроки взятия крови у больного ГФМИ - первые дни болезни (1-3 день), вторая, третья и последующая недели болезни.
Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении больного в стационар, последующие через 7 - 10 дней.
Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп А и С при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни.
Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на 2 - 3-ей неделях болезни, с 4 - 5 недели уровень антител постепенно снижается.