Для визначення рН молока запропоновані й інші індикатори - розолова кислота, нейтральрот, крезолрот, фенолрот, бромкрезолпурпур та ін. Проте вони менш чутливі порівняно з бромтимолблау.
Деякі автори вважають, що на початку розвитку субклінічного запалення і особливо при механічному подразненні вим’я молоко не завжди має нейтральну або слаболужну реакцію і тому індикаторами за зміною рН молока не завжди можна виявити всі випадки захворювання корів на субклінічний мастит.
Визначення підвищеної кількості лейкоцитів у молоці непрямими методами. Молоко корів при нормальному стані вим’я містить лейкоцити, лімфоцити, епітелій альвеол і молочних ходів. Запальний процес в молочній залозі супроводжується різким збільшенням цих клітин, особливо лейкоцитів. Для визначення підвищеної кількості лейкоцитів в молоці якісними (непрямими) методами застосовують реактиви димастин, мастидин, маститодіагност та ін.
Проба з димастином (за В.І. Мутовіним). Димастин - це порошок, до складу якого входить поверхнево-активна речовина (сульфонат), індикатор (фенолрот), гіпосульфіт і глауберова сіль. В сухому місці активність димастину зберігається протягом кількох років. Застосовується він у вигляді 5 %-ного розчину в дистильованій воді. Дослідження проводять на молочно-контрольних пластинках біля корів. Для цього з кожної частки вим’я видоюють по 1 мл молока і додають 1 мл розчину димастину з пляшки піпеткою-автоматом. Суміш перемішують дерев’яною, скляною або пластмасовою паличкою протягом 30 с. Реакцію оцінюють за утворенням згустку і забарвленням суміші.
Утворення желеподібного згустку пов’язане з вмістом у молоці великої кількості лейкоцитів. Його консистенцію позначають хрестами (від одного до чотирьох): один хрест (+) - дуже слабий згусток, суміш молока з реактивом тягнеться за паличкою у вигляді нитки; два хрести (++) - слабий згусток; три хрести (+++) - желе має консистенцію сирого курячого яйця, який важко викинути паличкою із заглибини пластинки; чотири хрести (++++) - дуже щільний згусток, який легко викидається паличкою із заглибини пластинки.
Реакція, позначена трьома хрестами, вважається сумнівною, чотирма – позитивною.
За допомогою димастину визначають також зміну реакції молока. Оранжеве забарвлення його свідчить про слабокислу реакцію (молоко від здорових корів),
червонувате (червоне, малинове, яскраво-червоне) – лужну і жовте - про кислу реакцію (молоко від хворих на мастит корів).
Проба з мастидином (за М.К. Оксамитним). До складу мастидину входить поверхнево-активна речовина (сульфонол) та індикатор (бромкрезолпурпур). Застосовується у 2 %-ній концентрації в дистильованій воді. Дослідження проводять також на молочно-контрольних пластинках безпосередньо біля тварин. Для цього в кожну заглибину пластинки до контрольної лінії з відповідної частки вим’я надоюють по 1 мл молока і додають 1 мл розчину мастидину з пляшки піпеткою-автоматом. Молоко з реактивом перемішують дерев’яною, скляною або пластмасовою паличкою протягом 15-20 с. Під час обліку реакції враховують забарвлення суміші та утворення желеподібного згустку.
Колір молока здорових корів з мастидином світло-бузковий (димчастий), при лужній реакції – фіолетовий і при кислій - майже білий (молоко від хворих на мастит корів).
М.К. Оксамитний (1973) вказує, що колір суміші має лише орієнтовне, допоміжне значення, а утворення згустку - основне діагностичне значення для оцінки результатів дослідження. Утворення желеподібного згустку молока з мастидином визначають так само, як і з димастином.
Наші дослідження, а також дані авторів свідчать, що мастидинова проба чутливіша, ніж димастинова.
Отже, для бромтимолової і мастидинової проб характерні простота і швидкість виконання, чіткість і контрастність реакцій. При одночасному застосуванні їх можна правильно поставити діагноз субклінічного маститу.
М.К. Оксамитний, І.П. Даниленко (1977) пропонують пов’язувати проведення контрольних надоїв з визначенням у молоці процента жиру та дослідженням його на мастит 10 %-ним розчином мастидину на молочно-контрольних пластинках. Якщо реакція проби молока з 10 %-ним розчином мастидину позитивна або сумнівна, то за
допомогою 2%-ного розчину мастидину досліджують паренхімне молоко з кожної частки вим’я.
Проба з маститодіагностом (за Й.С. Загаєвським). Для приготування маститодіагносту в 1 л дистильованої води, підігрітої до 70-75 ОС, розчиняють 50 г триполіфосфату натрію і 300 г порошку сульфонолу. Коли суміш розчиниться, її фільтрують крізь марлевий фільтр і після охолодження до 20-25 ОС додають до неї 0,2 г водорозчинного бромтимолблау і 5 мл 1 %-ного спирто-водного розчину розолової кислоти. Після 3-5 хв. збовтування препарат готовий до застосування. При температурі від 1 до 5 ОС активність маститодіагносту не знижується протягом 3 років.
У разі запального процесу в молочній залозі суміш з 1 мл молока і 1 мл маститодіагносту у пробірці при перемішуванні протягом 1-2 хв. набуває слизистої тягучої консистенції, що стікає з стінок пробірки у вигляді суцільного желеподібного згустку або слизових смужок чи тяжів. Якщо гомогенна суміш не змінюється, це свідчить, що запалення немає.
Й.С. Загаєвський для приготування маститодіагносту рекомендує в 1 л води розчинити 350 г миючого порошку (Супутник, Сумгаїт, Кристал, Наталка, Лотос, Аеліта та ін.), підігріти суміш, довести її, помішуючи, до кипіння, профільтрувати крізь марлю і додати 0,2 г водорозчинного бромтимолблау та 5 мл спирто-водного розчину розолової кислоти. Під час перевірки корів на захворювання можна користуватись молочно-контрольними пластинками, проте при дослідженні молока в пробірці показники реакції чіткіші.
Безперечно, що при виявленні субклінічних маститів на промислових комплексах слід користуватись молочно-контрольними пластинками.
Результати досліджень багатьох авторів показують, що найчутливішим реактивом у діагностиці субклінічних маститів є маститодіагност, за допомогою якого виявляють згасаючі і початкові стадії запального процесу, а також зміни якості молока не тільки при маститах, а й при деяких фізіологічних станах корів (молозивний період, перед запуском, стадія збудження статевого циклу, у старих тварин).
Оскільки маститодіагност виявляє зміни якості молока у здорових корів, О.І. Пучковський та інші (1973) рекомендують при остаточному діагнозі маститів провести старанне клінічне обстеження тварин, а деякі дослідники у зв’язку з цим вважають, що маститодіагност слід застосовувати тільки для визначення у збірному молоці домішок молока від корів, хворих на мастити.
Проба відстоювання (за В.І. Мутовіним). Після обмивання і витирання вим’я сухим рушником в окремі пробірки надоюють по 10-25 мл паренхімного молока з кожної частки. Пробірки з молоком тримають в холодильнику при температурі 4-7 ОС протягом 16-24 год. Перевіряючи молоко, звертають увагу на його колір, наявність осаду, товщину і характер вершків. Для субклінічного маститу характерне синювате, водянисте молоко, товщина шару вершків менш як 5 мм, інколи вони містять багато лейкоцитів або слиз і пластівці. Основною ознакою запалення вим’я вважають появу білого, кремового або жовтуватого осаду в об’ємі 0,1 мм і більше. Якщо осад незначний (менш як 0,1 мм), але вершки містять пластівців або змінився колір молока, корова вважається підозрілою на захворювання.
Більшість авторів вважають пробу відстоювання простою, але тривалою, трудомісткою, а також не досить ефективною у діагностиці субклінічних маститів. В той же час В.М. Кар- ташова та ін. (1975) вказують, що діагноз на субклінічний мастит має бути підтверджений пробою відстоювання або бактеріологічним дослідженням.
Для діагностики субклінічних маститів в умовах лабораторій проводять підрахунок лейкоцитів у молоці, бактеріологічне дослідження секрету вим’я, визначають активність каталази і лізоциму молока.
Визначення кількості лейкоцитів в молоці методами підрахунку. Підрахунок кількості лейкоцитів в молоці залишається достовірним критерієм для встановлення субклінічного маститу. Міжнародна федерація по молочній справі та більшість дослідників вважають наявність в 1 мл молока понад 500 тис. лейкоцитів ознакою запального процесу вим’я.
Визначення активності каталази. В молоці завжди містяться ферменти каталаза, редуктаза, діастаза, ліпаза та ін. Їх кількість залежить від ступеня обсіменіння молока мікроорганізмами. Збільшення ферментів у молоці свідчить про запальний процес у молочній залозі, зумовлений мікробами.
Визначення активності лізоцимів молока. Дослідженнями доведено, що молоко від здорових корів має високий титр лізоциму, а при субклінічному запальному процесі молочної залози та наприкінці лактації його вміст різко зменшується. У сухостійних корів, а також при різних захворюваннях лізоциму майже нема.
Бактеріологічні дослідження. Успішне проведення лікувальних і профілактичних заходів при захворюванні корів на мастити багато в чому залежить від швидкого і правильного визначення збудників запалення молочної залози.
Для бактеріологічного дослідження беруть паренхімне молоко у стерильні пробірки. Вим’я перед взяттям проб обмивають теплим 0,5 %-ним розчином миючого порошку або дезмолу, витирають змоченою у розчині хлорного вапна (0,025-0,05 % активного хлору) чи дезмолу і віджатою салфеткою. Шкіру дійок, особливо їхні кінчики, обробляють зволоженим у 70о денатурованому спирті тампоном. Видоювати молоко краще трьома пальцями, а не кулаком. Кінчик дійки при доїнні не повинен торкатися пробірки. Молоко досліджують відразу після взяття проб або не пізніш як через 4 год. Зберігати проби молока потрібно при температурі не вище 6 ОС, не допускаючи їх заморожування.
Майстер машинного доїння при взятті проб молока повинен чисто вимити руки і протерти ватним тампоном, зволоженим 70о денатурованим спиртом.