Дослідження антагоністичних властивостей сучасних пробіотиків (стр. 11 из 16)
2.2 Методи дослідження культурально-біохімічних властивостей штамів
Дослідження культуральних і ферментативних властивостей штамів продуцентів проводили загальноприйнятими методами, використовуючи диференціально-діагностичні середовища (середовище Ендо, Левіна, Плоскірева, Сабуро, КА,Цейсслера).
2.3 Метод визначення антагоністичної активності мікроорганізмів
Для оцінки явища мікробного антагонізму окремих компонентів та композицій пробіотичних продуктів, а також офіціальних препаратів-пробіотиків в умовах in vitro використовували відповідні методики [68]. Антагоністичну активність визначали по відношенню до патогенних та УПМ з колекції живих культур лабораторії загальної мікробіології КНДІЕІХ і до клінічних ізолятів, виділених із обстежених осіб, використовуючи метод відстроченого антагонізму.
Тест-культури
З метою оцінки антагоністичної активності виробничого штаму використовують тест-культури, які повинні знаходитись в S-формі клітинного циклу, володіти типовими морфологічними, серологічними, біохімічними властивостями і вірулентністю, яка визначається для мікробів кишкової групи величиною LD50 при внутрішньочеревному заражені білих мишей; для шигелл Флекснера повинна бути не більше 250 млн МК при зараженні суспензії живих мікроорганізмів в 0.9% розчині хлориду натрію або не більше 20 млн МК при зараженні в 0.4% голодному агарі; для S. sonnei - не більше 50 млн МК при зараженні в 0.9% розчині хлориду натрію; для штамів Proteus - не більше 350 млн МК в 0.9% розчині хлориду натрію і 30-50 млн МК в 0.4% голодному агарі.
Тест-культури шигелл Флекснера і Зонне повинні давати позитивну кератоконюктивну пробу у морських свинок.
Тест-культури стафілококу повинні володіти наступними властивостями: утворювати зону гемолізу розміром (3-5) мм через (19±1) годин росту на МПА з 0.5% крові (людини, барана, кроля), розлитому в чашки Петрі шаром (2-3) мм; коагулювати плазму крові кроля на протязі (2±1) годин; викликати некроз при підшкірному введенні 200 млн МК добової культури в 0.2 см3 0.9% розчину хлориду натрію кролям вагою (1.5±0.2) кг на протязі 48-72 годин.
Антагоністичну активність штамів перевіряли до таких музейних штамів як S.flexneri, S.sonnei, ентеропатогенних E. coli, S.aureus, Proteus vulgaris i Proteus mirabilis (стандартних тест-штамів, які використовуються для контролю антагоністичної активності пробіотиків) та клінічних ізолятів. Стандартні тест-штами ідентифіковані по тестам сучасної класифікації, мають певні властивості, які визначають їх видову характеристику.
Виробничі штами повинні володіти високою антагоністичною активністю по відношенню до всіх вказаних тест-культур. Зони відсутності росту тест-культур повинні бути не менше 10 мм.
Музейні культури мікроорганізмів перед використанням активізували із ліофілізованого стану перенесенням в середовище м`ясо-пептонного бульйону (3-5 мл на одну ампулу), інкубували при 37ºС 1-3 доби та після одержання густої суспензії мікробних клітин переводили на агаризоване середовище (МПА).
Для визначення антагонізму виробничих штамів використовували метод препендикулярних штрихів на твердому поживному середовищі, сутність якого полягала в наступному: на підсушені чашки Петрі із середовищем МПА по діаметру петлею діаметром (3,5
0,5)мм висівали штрихом суспензію двохдобової культури пробіотичних мікроорганізмів в концентрації 1 млрд МК в 1мл ізотонічного розчину NaCl. Посіви інкубували в термостаті при (37 1)ºС. Через 2 доби перпендикулярним штрихом до отриманої полоси росту відступив на 1-2мм підсіювали суспензію однодобових культур тест-штамів мікроорганізмів в концентрації 10 
МК в 1 мл. Досліди проводили в 3-х повторюваннях. Результати враховували через 18год інкубування за величиною зон пригнічення росту тест-штамів (вимірюючи ці зони лінійкою: від дослідженої культури до початку росту тест-культури в мм). Контролем росту тест-культур слугував їх паралельний посів штрихом на чашки із тим же середовищем (МПА) без досліджуваної культури. Позитивним вважали результат при відстані затримки росту тест-штаму більший за 7 мм.В кожному випадку розраховували для кожного тест-штаму середнє арифметичне значення затримки росту та його похибку (М
m).2.4 Методи математичної обробки результатів досліджень
Для обробки експериментальних матеріалів, отриманих при проведені досліджень, застосовують методи математичної статистики. За допомогою математичної статистики можна оцінити відтворюваність аналізу; встановити величину випадкових похибок; виключити результати, які містять промахи; встановити правильність отриманого результату; оцінити надійність результатів досліджень [67].
Важливою характеристикою випадкових величин є середньоарифметичне значення випадкової величини і її дисперсія.
Середньоарифметичне значення випадкової величини дорівнює сумі результатів всіх визначень, розділеній на їх кількість. Якщо х1, х2, х3,..., хі,..., хn означають n результатів визначень будь-якої величини, отже середньоарифметичне з n результатів буде:
(2.4.1)З теорії похибок, середньоарифметичне є найбільш вірогідним і найкращим значенням величини, яка визначається.
Дисперсія показує яким чином групуються всі отримані результати аналізу навколо середньоарифметичного, тобто характеризує ступінь розкиду
навкол 
. 
(2.4.2)Середньоквадратична похибка окремого вимірювання визначається з рівняння дисперсії:
(2.4.3)Інтервал значень, в який потрапляє вимірювана величина, називається довірливим інтервалом.
Вірогідність потрапляння нового результату у довірливий інтервал називається довірлива імовірність, надійність або коефіцієнт надійності і позначається літерою a.
Найчастіше користуються величиною надійності a=0,95, яка означає, що при великій кількості дослідів 95 результатів на кожні 100 будуть мати значення в межах
±2s.Приведені вище рівняння стандартного відхилення і дисперсії можна використовувати для характеристики випадкових похибок, знайдених при достатньо великій кількості дослідів (при n®¥).
Оцінку точності і правильності досліджень проводять за наступними критеріями:
середньоарифметичне значення
, розраховується за (2.4.1);одиничне відхилення або відключення окремих визначень від середньоарифметичного:
(2.4.4)Алгебраїчна сума одиничних відхилень дорівнює нулю:
(2.4.5)Дисперсія знайдених значень х1, х2,..., хn при n паралельних дослідів визначається:
(2.4.6)- стандартне відхилення або середньоквадратична похибка окремого вимірювання:
(2.4.7)Відносна квадратична похибка, виражена у відсотках від середньоарифметичного значення, називається коефіцієнтом варіації і позначається літерою u:
(2.4.8)Дисперсія середнього результату при n паралельних дослідів складає n-ну частину початкової дисперсії:
(2.4.9)Стандартне відхилення середнього результату (середньоквадратична похибка середнього арифметичного результату) є позитивним значенням кореня квадратного з дисперсії середнього результату:
(2.4.10)Для визначення значення n, при якому значення
наближується до істинного значення а, вводиться нова величина, яку називають коефіцієнтом Ст’юдента і позначають символом ta: 
(2.4.11)Є таблиця коефіцієнтів, де даються значення ta залежно від коефіцієнта надійності a та числа ступенів свободи k (k = n-1, де n – число дослідів).
Точність результату аналізу при вибраному a визначається величиною відхилення середнього результату від істинного (очікуваного) і виражається рівнянням:
(2.4.12)Довірливий інтервал та довірлива вірогідність (надійність) при вибраному коефіцієнті надійності a описується рівняннями:
(2.4.13) 
(2.4.14)Із збільшенням кількості дослідів, точність результатів зростає. Коли відоме істинне значення, відносна похибка середнього результату (у %) з надійністю a знаходять як відношення: