Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини (стр. 2 из 5)
За матеріалами дисертаційних досліджень було створено науково-технічний проект №76/4: “Модифікація і застосування швидкого культурального методу, як нової технології діагностики цитомегаловірусної інфекції людини” (Київ, 2004), за конкурсом автор отримав “Відзнаку” від Київської міської держадміністрації.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праці, в тому числі, 3 статті у провідних фахових журналах, 2 патенти України на винаходи та 4 тези доповідей на наукових конференціях.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів і об’єктів досліджень, експериментальної частини, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел та додатків. Робота викладена на 125 сторінках основного тексту, містить 5 таблиць, 17 рисунків. Список використаних джерел включає 265 робіт вітчизняних та іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури складається із чотирьох розділів, в яких докладно викладено сучасні уявлення про структуру та біологічну активність ЦМВ, його роль в інфекційній патології людини, огляду сучасних методів лабораторної діагностики ЦМВ та ідеології профілактики та лікування ЦМВ-інфекції.
Матеріали та методи дослідженнь. У роботі використано цитомегаловірус людини (референс-штам ЦМВ AD 169) люб'язно наданий доктором L. Pereira (Медичний Центр, Університет Сан-Франциско, США). У дослідах використовували первинну культуру клітин ФЛЕЛ (фібробластів легень ембріона людини), яка входить до Каталогу Європейської колекції культур клітин. Культивування культури клітин ФЛЕЛ проводили використовуючи такі поживні середовища, як Ігла ДМЕМ, Ігла МЕМ, з використанням розчину Версену та Хенксу виробництва фірми “Панеко” (Росія) та Хімопсину фірми “Самсон-Мед” (Росія). Як стимулятор росту використовували ембріональної телячу сироватка виробництва фірми “Hy Clone” (США) чи “Biowest” (Франція) та пуповинну сироватку людини виробництва фірми “Панеко” (Росія). Дослiджували лімфоцити та сироватки периферичної крові від 50 дітей віком від одного дня до першого року життя, що перебували на лікуванні у Центрі корекціїрозвитку дітей раннього віку та від 17 реципієнтів нирки, що знаходились на лікуванні у Науково-дослідному інституті трансплантології та штучних органів.
При дослідженнях використовували буферні розчини: 0.01 М фосфатно-сольовий буфер рН 7,5, який містить 0,1 М NaCl, 0,025M KCl, 0,025M KH2PO4, 0,036M Na2HPO4x12H2O; 0,005 М розчин Трис- HCl рН 7,4, який містить 0,1 М Na Cl та оригінальні очищені МКА до білків р72, рр65, gВ ЦМВ, що були отримані Макаровою Н.Е. в НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, у робочих розведеннях 1:100. Як контроль використовували комерційні діагностичні МКА фірми “Ortho” (США). Як кон'югат використовували поліклональні кролячі анти-мишачі імуноглобуліни, мічені пероксидазою хрону “DakoCytomation” (Данія) у робочому розведенні 1:100. Як субстрат використовували диамінобензидин “Bioscinces” (США) в концентрації 10 млг DAВ розведеного в 20 мл 0,005 М розчині буферу ТРИС рН 7.4 з додаванням 20 мкл 30% перекису водню (розрахунок на один планшет). При проведенні досліджень використовували комерційні тест-системи “Enzygnost Anti-CMV/Ig” фірми Behring та ELISa фірми “HUMAN” Німеччина, для визначення специфічних антитіл класів М і G у сироватках крові до ЦМВ методом ІФА.
ДНК ЦМВ в зразках сироваток крові дітей та реципієнтів нирки виявляли за допомогою реактивів набору ЦИТОПОЛ (ТУ-9398-428-17253567-01) виробництва ТОВ НПФ "Літех" Москва і ТОВ НПФ "ГЕНтех" Москва. ІФА та ПЛР у цих випадках та облік результатів здійснювали відповідно до інструкцій фірм-виробників.
Антигенвмісні включення у клітинах ЦМВ виявляли методом імуноцитохімічного забарвлення (кількісний варіант), досліджуючи препарати лейкоцитів периферичної крові хворих, забарвлених МКА до рр65.
Антивірусну дію 6-azaC чи 2-ß-Д-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-ОН (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України) та амізону чи 4-(N-бензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид (Інститут фармакології і токсикології АМН України) щодо ЦМВ вивчали за методичними рекомендаціями (Щербинська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та інш., 2000 ). Як контрольний препарат застосовували ганцикловір “Roche” (Швейцарія). Антивірусні сполуки досліджували в системі in vitro у трьох схемах: 1. терапевтична (робочі концентрації вносились після 24 г. інфікування клітин); 2. профілактична (робочі концентраціях вносились за 24 год. до інфікування клітин); 3. профілактична накопичувальна (робочі концентрації вносились за 48, 24 та 1 год. до інфікування клітин). Отримані дані виражали графічно у вигляді дозозалежної кривої, за допомогою якої визначали 50% ефективну дозу (ЕD50), що зменшує кількість сформованих включень у клітинах на 50%. В результаті проведених досліджень визначали цитотоксичну дозу (CD50), ефективну дозу (ED50) та індекс селективності (IS) досліджуваних сполук, який розраховували за формулою: ІS = CD50 / ED50.
Результати були оброблені статистично за допомогою ком’ютерної програми Microsoft Excel-2000.
Виявлення ранніх білків ЦМВ за допомогою методів експрес діагностики.На першому етапі досліджень виявляли антиген ЦМВ у 50 новонароджених та дітей раннього віку. Дослідження проводили двома методами – швидким культуральним та ІФА, використовуючи лейкоцитарні фракції та сироватки крові отримані від дітей. Відповідно до класифікації клінічних проявів ЦМВІ, немовлят було розділено на дві групи. До першої - віднесли 23 дитини з клінічними симптомами перинатального інфікування ЦМВІ. До другої групи віднесли 27 дітей, яким діагноз ЦМВІ неонатологами та педіатрами поставлено не було.
Визначення класів Ig показало, що 96+0,82% зразків сироваток крові дітей 1-ої групи містили IgG, у той час, як у дітей 2-ої групи вони були зафіксовані у 59+0,49% обстежених (рис. 1). Найбільшу зацікавленість представили результати виявлення анти-ЦМВ IgМ, які розглядались як показник початкової стадії або гострої форми інфекції. IgМ були виявлені в сироватках крові 17+0,47% дітей з клінічними ознаками та у 22+0,51% дітей без клінічних ознак ЦМВІ (p<0,05). Швидким культуральним методом у дітей першої групи антиген ЦМВ було виявлено у 17 осіб, що складало 74%. Тоді як у дітей другої групи антиген ЦМВ виявлено не було. Останнє свідчить про високий рівень безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції, і спостерігається навіть у її гострій формі.
 |
Рис. 1. Виявлення маркерів ЦМВ ІФА та ШКМ у крові дітей раннього віку
Проведене нами порівняння результатів 2-х лабораторних методів, що використовувались для діагностики ЦМВІ у обох групах дітей раннього віку, показало, що у обстежених дітей 1-ої групи (з клінічними ознаками ЦМВІ) IgМ та антиген ЦМВ одночасно було виявленj швидким культуральним методом у 3-х випадках, що складало 13+0,47% (табл. 1). Наявність у сироватках дітей цієї групи імуноглобулінів класу G супроводжувалося виявленням антигену ЦМВ швидким культуральним методом у 15 дітей (65%). У дітей другої групи (без клінічних ознак ЦМВІ) IgM було виявлено у 6 осіб, що сладало 22+0,47%, а IgG у 12 осіб, що складало 59+0,49%, тоді як антиген ЦМВ швидким культуральним методом виявлено не було (табл. 2). Одночасно IgG та IgM у дітей 2-ої групи було виявлено у 4 осіб, що складало 15+0,81% від загальної кількості дітей у групі.
Таблиця 1
Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку з клінічними проявами ЦМВІ ІФА та ШКМ
| № п/плейкоцитарних фракцій крові | Імуноферментний метод ELISa фірми “HUMAN” | Швидкий культуральнийМетод | |
| Anti-CMV/IgG | Anti-CMV/Ig M | p 72 + pp 65 | |
| середнє значенняоптичної густини *(ОО), (M+m) | середнє значенняоптичної густини *(ОО), (M+m) | кількість антигенвмісних клітинна 2х105 клітин ФЛЕЛ | |
| 1 | 0,300+0,04 | 0 | 1 |
| 2 | 0,313+0,009 | 0 | 2 |
| 3 | 0,500+0,015 | 0 | 2 |
| 4 | 0,805+0,02 | 0,313+0,009 | 3 |
| 5 | 0,298+0,009 | 0 | 2 |
| 6 | 0,529+0,02 | 0 | 4 |
| 7 | 0,368+0,01 | 0 | 0 |
| 8 | 0 | 0 | 1 |
| 9 | 0,400+0,012 | 0 | 2 |
| 10 | 0,300+0,009 | 0 | 0 |
| 11 | 0,300+0,009 | 0 | 2 |
| 12 | 0,800+0,02 | 0,744+0,02 | 4 |
| 13 | 0,700+0,02 | 0 | 5 |
| 14 | 0,800+0,2 | 0 | 0 |
| 15 | 0,500+0,015 | 0 | 0 |
| 16 | 1,496+0,04 | 0 | 4 |
| 17 | 1,020+0,03 | 0,320+0,009 | 6 |
| 18 | 1,110+0,03 | 0 | 5 |
| 19 | 1,617+0,05 | 0 | 4 |
| 20 | 0,300+0,009 | 0 | 2 |
| 21 | 1,580+0,05 | 0,450+0,01 | 0 |
| 22 | 0,600+0,012 | 0 | 5 |
| 23 | 1,230+0,036 | 0 | 0 |
| Позитивний результат | 1>0,250 ОО | 2>0,250 ОО | > 1 клітини |
Примітки:
1. 1,2 Значення позитивного результату вираховували згідно інструкції виробоника тест-системи;
2. *О/О – оптичні одиниці
Таблиця 2
Порівняльне дослідження виявлення ЦМВ у крові немовлят та дітей раннього віку без клінічних проявів ЦМВ-інфекції ІФА та ШКМ
| № п/пЛейко лейко них фракцій крові | Імуноферментний метод ELISa фірми “HUMAN” | Швидкийкультуральний метод | |
| Anti-CMV/Ig G | Anti-CMV/Ig М | p72 + pp65 | |
| середнє значення оптичної густини*(ОО), (M+m) | середнє значенняоптичної густини*(ОО), (M+m) | кількість антиген-вмісних клітин на 2х105 клітин ФЛЕЛ | |
| 1 | 0,397+0,01 | 0,190+0,006 | 0 |
| 2 | 0,36 +0,01 | 0 | 0 |
| 3 | 0,340+0,01 | 0 | 0 |
| 4 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 0,650+0,02 | 0 | 0 |
| 8 | 0 | 0 | 0 |
| 9 | 0,620+0,02 | 0 | 0 |
| 10 | 0,556+0,016 | 0,345+0,01 | 0 |
| 11 | 1,403+0,04 | 0 | 0 |
| 12 | 0,335+0,01 | 0 | 0 |
| 13 | 0,316+0,01 | 0 | 0 |
| 14 | 0,637+0,019 | 0,340+0,01 | 0 |
| 15 | 2,098+0,06 | 0,440+0,01 | 0 |
| 16 | 0,868+0,03 | 0 | 0 |
| 17 | 0 | 0 | 0 |
| 18 | 0 | 0 | 0 |
| 19 | 0 | 0,550 +0,02 | 0 |
| 20 | 0 | 0 | 0 |
| 21 | 0 | 0 | 0 |
| 22 | 0,516+0,02 | 0 | 0 |
| 23 | 1,570+0,05 | 0 | 0 |
| 24 | 2,445+0,07 | 0 | 0 |
| 25 | 0 | 0 | 0 |
| 26 | 0,699+0,02 | 0 | 0 |
| 27 | 0 | 0,300+0,009 | 0 |
| Позитивний результат | 1>0,250 ОО | 2>0,250 ОО | > 1 клітини |
Примітки: