Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини (стр. 4 из 5)

Структурний білок gВ

був зареєстрований у 2,5% клітин контрольної культури через три доби після зараження, у той час як у клітинах оброблених 6-azaC у концентраціях 1000 мкг/мл і 3000 мкг/мл кількість клітин, що ситезували gВ складало 1% і 0,5% відповідно. Максимальне розходження результатів у числі клітин, що синтезували gВ, було відзначено на п’яту добу після зараження, коли число клітин, що містили вірусний білок у необробленій популяції було у 10 разів більше, ніж у досліді. Під дією 6-azaC і ганцикловіру нагромадження пізнього структурного білку gВ було знижено приблизно однаковою мірою.

Таким чином було встановлено, що (СD50)6-azaC, що не спричиняла незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин на 3-ю добу складала – 24000 мкг/мл, а концентрація препарату що на 50% пригнічувала синтез ДНК (CD50) становила - 2400 мкг/мл. 50% ефективна доза (ЕD₅₀) у терапевтичній схемі застосування при ІМ 0,001 БУО/кл відповідала 100 мкг/мл, при ІМ 0,0001 БУО/кл – ED₅₀ - 50 мкг/мл. Індекс селективності (ІS) для 6-azaC в залежності від множинності інфікування складав 48-240.

Оцінка анти-ЦМВ активності амізону. Цитотоксичність амізону за дією на життєздатність клітин вивчали використовуючи сполуку у концентраціях 0,1 мкг/мл - 1000 мкг/мл. Протягом першої доби культивування амізон виявляв незначну цитотоксичну дію (рис. 8). На 3-ю добу культивування при концентрації амізону 1000 мкг/мл спостерігалася загибель 80% клітин. У присутності препарату амізон у концентрації 800 мкг/мл кількість життєздатних клітин становила 50% від загального числа клітин, а при концентрації 500 мкг/мл - 70%. Амізон у концентрації 200 мкг/мл виявляв незначну цитотоксичну дію, кількість нежиттєздатних клітин становила менше 10%. У нижчих концентраціях цитотоксичної дії препарату не спостерігалось. Цитотоксична доза (СD50), яка зменшувала кількість життєздатних клітин для амізону становила 800 мкг/мл.

Дію амізону на синтез ДНК клітин ФЛЕЛ з використанням методу мічення клітинної ДНК, досліджували в концентраціях 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл, 800 мкг/мл та 1000 мкг/мл (рис. 9). Підрахунок клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, показав, що у культурі, не обробленій амізоном, через добу 30% клітин перебували у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалась. Через три доби їх кількість становила 12%. У культурі, обробленій амізоном у концентраціях від 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, число клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, через добу культивування незначно відрізнялось від контролю. При концентраціях препарату 100 мкг/мл та 800 мкг/мл число мічених клітин щодо контролю становило 60% і 30% відповідно. Через три доби число клітин, що синтезують ДНК, знизилось щодо контрольної популяції на 50% у присутності 100 мкг/мл амізону, при концентрації 800 мкг/мл на 100%. Таким чином, отримані дані показали, що на 3-ю добу 50% зниження числа клітин, що синтезують ДНК (CD50), відбувається при концентрації амізону 100 мкг/мл.

Рис. 8. Цитотоксичний вплив амізону на кількість життєздатних клітин ФЛЕЛпо осі ординат- % життєздатних клітин від контролю клітин,по осі абсцис – концентрація амізону, мкг/мл	Рис. 9. Цитотоксична дія амізону на пригнічення синтезу ДНК клітин ФЛЕЛпо осі ординат - % віл контролю клітин, що синтезують ДНК,по осі ординат- концентрація амізону, мкг/мл

Крім того, вивчали приріст клітин у контрольній і дослідній культурах. Для цього проводили підрахунок числа клітин на одиницю площі. Через три доби культивування відбувалося зменшення числа клітин на 50% щодо контрольної популяції при концентрації амізону 100 мкг/мл. Таким чином, концентрація препарату, що пригнічувала синтез ДНК на 50% та інгібувала приріст клітин на 50% для амізону складала 100 мкг/мл, виявилася значно нижче концентрації, що впливала на життєздатність клітин – 800 мкг/мл.

Дослідження анти-ЦМВ активності амізону у терапевтичній схемі досліджували у концентраціях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,1 мкг/мл та при ІМ вірусу 0,001 БУО/кл та 0,0001 БУО/кл. Ні при одній із досліджуваних концентрацій амізону та інфекційній множинності вірусу препарат не виявляв інгібуючої активності відносно ЦМВ.

Дослідження впливу амізону на репродукції ЦМВ у профілактичній схемі було вивчено в присутності препарату у концентраціях 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, з ІМ вірусу 0,0001 БУО/кл й 0,001 БУО/кл (рис. 10). Присутність амізону у концентрації 5 мкг/мл при зараженні ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл приводила до пригнічення вірусоспецифічної ЦПД через 5 діб на 90%, з ІМ 0,001 БУО/кл - на 70%. Амізон у концентрації 1 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 70%, при ІМ 0,001 БУО/кл на 40%. Зменшення цитопатичної дії ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл було виявлено при концентрації 0,1 мкг/мл на 60%, із ІМ 0,001 БУО/кл - на 40%. Амізон у концентрації 0,05 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 40% та при ІМ 0,001 БУО/кл на 30%.

Вплив амізону на розвиток ЦМВІ у клітинах ФЛЕЛ було вивчено також при використанні накопичувальної профілактичної схеми (рис. 11). Для цього препарат у концентраціях сполуки 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл та 0,001 мкг/мл тричі вносили у культуру клітин - за 48 год., за 24 год. і за 1 год. до внесення вірусу (ІМ 0,001 БУО/кл і 0,0001 БУО/кл). Дослідження концентрацій сполуки показало, що ефективна доза (ЕD50) зменшується до 10% при вивченні усіх концентрацій амізону у порівнянні із ЕD50 ЦМВ у звичайній профілактичній схемі.

Таким чином, вивчення антивірусної дії амізону показало, що препарат ефективно пригнічував розвиток ЦМВІ у культурі клітин при профілактичній схемі застосування. Було встановлено, що цитотоксична доза (CD₅₀), що відповідає концентрації амізону, при якій спостерігалося 50% інгібування ЦПД ЦМВ, із ІМ 0,001 БУО/кл становила 1 мкг/мл, а з ІМ 0,0001 БУО/кл - 0,1 мкг/мл, IS в залежності від інфекційної множинності складав 100 – 1000.

Рис. 10. Анти-ЦМВ активність амізону у профілактичній схеміпо осі ординат - % пригнічення формування включень від контролю вірусу,по осі абсцис – концентрація амізону, мкг/мл	Рис.11. Анти-ЦМВ активність амізону у профілактичній накопичувальній схеміпо осі ординат - % пригнічення формування включень від контролю вірусу,по осі абсцис – концентрація амізону, мкг/мл

Результати дослідження дії амізону на синтез ЦМВ білків при ІМ 0,001 БУО/кл. показали, що протягом трьох діб спостереження число клітин, що містили білки р72 і рр 65 у культурі, попередньо обробленій амізоном, практично не відрізнялось як від контрольної популяції клітин, так і від культури, обробленої ганцикловіром. Кількість клітин, що містила структурний вірусний білок gВ, у контролі та у досліді вірогідно не відрізнялась протягом перших двох діб. Через три доби після зараження вірусний білок gВ у контрольній культурі був визначений у 2,5% клітин. У клітинах, оброблених амізоном, кількість клітин, що містили gВ, становила 0,5%. На п’яту добу після зараження спостерігалось найбільше розходження між контрольною і дослідною культурами у кількості клітин, зафарбованих МКА до gВ. Так, число клітин, що синтезують gВ у культурі, обробленій aмізоном, ганцикловіром і у контрольній культурах склало 3%, 1,8% і 10%, відповідно. Таким чином, на п’яту добу після зараження, під дією aмізону накопичення пізнього структурного білку gВ було знижено приблизно у 3 рази щодо контрольної популяції. Таким чином, амізон пригнічував синтез пізніх структурних білків, продукція яких залежить від реплікації вірусної ДНК.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено вирішення актуального наукового завдання щодо удосконалення ранньої лабораторної діагностики цитомегаловірусної інфекції та визначення нових вітчизняних хіміотерапевтичних засобів, що володіють противірусними властивостями.

1. Показано високу діагностичну цінність застосування методу культур клітин ФЛЕЛ у лабораторній діагностиці, який дозволяє протягом 24 год. виявляти ранні білки (р72 та рр65) ЦМВ і цим підтвердити розвиток гострої форми ЦМВІ у 65%-70% обстежених хворих.

2. Доведено ефективність виявлення у лейкоцитах крові раннього білку ЦМВ рр65, за допомогою моноклональних антитіл, як маркеру активації ЦМВІ на прикладі хворих після трансплантації нирки.

3. Встановлено активність 6-аzaC проти ЦМВ та визначено критерії цієї активації: цитотоксичну дозу (CD₅₀), по дії на ДНК - 2400 мкг/мл, ефективну дозу (ED₅₀) - 50 мкг/мл та індекс селективності (IS) 48.

4. Встановлено активність амізону проти ЦМВ та визначено критерії цієї активації: цитотоксичну дозу (CD₅₀) по дії на ДНК - 100 мкг/мл, ЕD₅₀ (1 мкг/мл), IS (100).

5. Доведено, що механізм антивірусної дії 6-azaC та амізону проявляється пригніченням синтезу пізнього структурного білку ЦМВ – gВ. Вивчені препарати не впливають на синтез ранніх білків р72 та рр65.