Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно створено рекомбінантні плазміди, оптимізовано умови детекції наявності гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах ссавців, оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини in vitro та in vivo. Виділення та очищення плазмідної ДНК, виділення тотальної хромосомальної ДНК з клітин ссавців, ПЛР та імунохімічне дослідження експресії гена АРОА1 людини виконані безпосередньо здобувачем. Роботи із культивування культури клітин СНО-К1, одержання транзиторно експресуючих та стабільно трансфікованих клітин СНО-К1, проводились спільно з м.н.с. Т. А. Рубан та н.с. О. М. Сухорадою. Розрахунок схем конструювання рекомбінантних плазмід та розрахунок праймерів було проведено спільно із м.н.с. Д. М. Іродовим. Роботи, пов’язані із піддослідними тваринами проводили у співробітництві з Інститутом геронтології АМН України. Розробка програми вирішення поставлених завдань, аналіз і обговорення одержаних результатів досліджень проведені спільно з м.н.с. Д. М. Іродовим, д.мед.н. С. Н. Новіковою, м.н.с. О. К. Топоровою, а також завідувачем відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України, академіком АМН України В. А. Кордюмом, з якими автор має спільні публікації.
Автор висловлює подяку науковому керівнику д.б.н., професору, чл.-кор. НАН України, академіку АМН України В. А. Кордюму за корисні поради та критичні зауваження, а також всім співробітникам, які сприяли її виконанню.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з’їздах: XXX Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Аахен, Німеччина, 2003), Конференції, присвяченій 50-річчю відкриття подвійної спіралі ДНК (Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, Україна, 2003), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), XXXI Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Варшава, Польща, 2004), Конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006» (Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна, 2006), ХІV Щорічному міжнародному конгресі європейського товариства генної терапії (Афіни, Греція, 2006), а також на наукових семінарах відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та тези 6 доповідей на конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, які представлені у 5-ти розділах, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (328 найменувань). Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 35 рисунками і 4 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали і методи дослідження. В роботі використано штами Escherichiacoli (E. coli) DH10B, SureII. Дослідження проводили на культурах клітин СНО-К1 і СПЕВ, щурах лінії Вістар та кролях породи Шиншила.
Для конструювання векторів експресії використовували плазміди pTRhCMV-IEapo (Топорова і співав., 2004), pBacMam-1 «Novagen» (США), pTR-GT60 (Кордюм і співав., 2003), pTRUFneoR- та pTRUF, які були люб`язно надані С. Золотухіним(Gene Therapy Center Vector Core Lab, США), pBluSKM («Fermentas», Литва), pTR-EGFP (Кордюм і співав., 2004).
Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію фрагментів ДНК, гідроліз ДНК рестриктазами, лігування ДНК, ПЛР) виконували згідно зі стандартними методами (Sambrook etal., 1989). Тотальну ДНК клітин виділяли за допомогою набору реактивів «Genomic DNA Purification kit» («Fermentas»). У процедурах молекулярного клонування застосовували ферменти виробництва «Fermentas». Тотальну ДНК/РНК з клітин печінки та крові тварин виділяли набором реактивів Рибо-золь А («Амплісенс», Російська Федерація). ДНК в пробах гідролізували за допомогою дезоксирибонуклеази 1 («Sigma»). Синтез кДНК проводили з використанням набору реактивів «Реверта L-100» («Амплісенс»).
Трансфекцію клітин ссавців invitro та invivoздійснювали за допомогою розгалуженого ПEI (25 кДа, «Aldrich» (США)). Препарат ДНК/ПЕІ готували у масовому еквіваленті 1:2, додаючи при перемішуванні розчин ПЕІ до розчину плазмідної ДНК.
При трансфекції до 5∙105 клітин СНО-К1 вносили 5 мкг препарату плазмідної ДНК/ПЕІ. Відбір стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 проводили на середовищі F10, що містить 20 % ембріональної телячої сироватки та 1 мг/мл антибіотика G418. Аналіз наявності білка АРОА1 у культуральному середовищі трансфікованих клітин СНО-К1 здійснювали методами ELISA, дот-блот та Вестерн-блот аналізу з використанням моноклональних антитіл MGHLaa («ИМТЕК», Російська Федерація).
Препарат ДНК/ПЕІ вводили ін`єкцією в паренхіму печінки піддослідних тварин: по 100 мкг та 240 мкг ДНК на тварину − щурам та кролям, відповідно. Введення препарату тваринам проводили при ультразвуковому дослідженні або при операції. Всі процедури проводили з використанням анестезуючих препаратів, згідно загальноприйнятих міжнародних правил поводження з тваринами. Аналіз наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів здійснювали Вестерн-блот аналізом із використанням моноклональних антитіл 3F10 («ICN»,США). Кролям, які утримувались на холестериновій дієті щодня орально вводили 1,5 % розчин холестерину у рослинній олії з розрахунку 1 мг холестерину / кг ваги тварини. Визначення концентрації тотального холестерину у плазмі крові тварин проводили з використанням набору реактивів фірми «Sentinel Diagnostics» (Італія) та «Elitech Diagnostics» (Франція). Препарати тканин органів кролів готували згідно загальноприйнятих методів (Лили, 1969). Зрізи тканин забарвлювали розчинами гематоксиліну та еозину за Ван-Гізоном.
Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Statistica 6.0.
Результати досліджень та обговорення. Для корекції дефіциту певного білка в організмі необхідно підтримувати таку концентрацію цільового білка, що відповідає його фізіологічній нормі або має терапевтичний ефект. При цьому для кожного білкового продукту ця концентрація буде індивідуальною. Фізіологічна концентрація АРОА1 у плазмі крові людини становить – 1,47±0,17 мг/мл (Bekaertetal., 1993). Таким чином, для корекції атеросклерозу необхідне досягнення високого рівня експресії трансгена АРОА1 людини.
Конструювання рекомбінантних плазмід для експресії АРОА1 людини in vitro та in vivo. На сьогодні створено велику кількість гібридних промоторів, які мають вищу швидкість ініціації транскрипції порівняно з промотором hCMV-IE. Продемонстровано, що введення до складу вектора експресії деяких геномних елементів, зокрема, інтронів та 3`- і 5`- послідовностей, які не транслюються, підвищує рівень експресії трансгена як in vitro (Palmiteretal., 1991) так і в трансгенних тваринах (Ebertetal., 1998). Механізм впливу таких послідовностей на рівень експресії трансгенів не в усіх випадках відомий, але його пов`язують з такими явищами, як підвищення частоти ініціації транскрипції, стабільності і ефективності транспорту і/або підвищення ефективності формування 3`-кінця мРНК при її дозріванні (Kawamotoetal., 1998). Тому, одним із перспективних шляхів підвищення рівня експресії трансгена є використання послідовностей, що містять не лише промотор, а також і перший інтрон гена, транскрипцію якого регулює даний промотор чи промотор іншого гена, у випадку гібридних послідовностей. В експериментах із використанням маркерних генів показано, що послідовності CAG та hCMV-ІA забезпечують вищий рівень синтезу трансгена in vitro порівняно з hCMV-IE (Niwaetal., 1991; Chapmanetal., 1991; Xiaetal., 2006). З використанням цих промоторів одержано трансгенні тварини (Okabeetal., 1997; Ishiietal., 1997) та здійснено експресію трансгенів in vivo (Xuetal., 2001). Враховуючи дані літератури, використання цих елементів регуляції транскрипції видається перспективним для підвищення рівня експресії трансгена АРОА1 людини в клітинах ссавців.
Як трансген у роботі використано повнорозмірний геномний варіант гена АРОА1 людини (рис. 1).
Для оцінки впливу вищезазначених гібридних послідовностей на експресію гена АРОА1 людини крім вихідної плазміди pTRhCMV-IEapo, яку створено співробітниками нашого відділу раніше (Топорова і співав., 2004), було сконструйовано рекомбінантні плазміди pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo. Для конструювання вектора експресії pTRCAGapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промоторhCMV-IE було замінено на CAG. Для одержання цільової плазміди pTRhCMV-IAapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE було замінено на hCMV-ІA.
Для вивчення рівня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1, до складу плазмід pTRhCMV-IEapo,pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo було клоновано ген неоміцинфосфотрансферази (neoR), який дозволяє відбирати клітини на селективному середовищі з антибіотиком G418 та отримано плазміди pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoR, pTRhCMV-IAapo neoR.
Транзиторна експресія гена АРОА1 клітинами СНО-К1. Нами було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різних елементів регуляції транскрипції транзиторно та стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1.
Перевагами використання транзиторної системи експресії є незалежність рівня експресії трансгена від «ефекту положення», тобто впливу регуляторних хромосомних елементів, оскільки експресія трансгена відбувається з неінтегрованих послідовностей. Дослідження рівня транзиторної експресії трансгена трансфікованими клітинами СНО-К1 проводили після трансфекції клітин препаратами ДНК/ПЕІ з рекомбінантними плазмідами: pTRhCMV-IEapo, pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo, що містять у своєму складі ген АРОА1 людини.