Наявність плазмідної ДНК у трансфікованих клітинах визначали на 6-ту добу після трансфекції за допомогою методу «nested» ПЛР. Для проведення ПЛР використовували розраховані нами за допомогою програми Vector NTI Advance 10 пари праймерів Ap-r/Ap-f та Ap(n)-f /Ap(n)-r (Гільчук та співав., 2006).
Синтезований АРОА1 людини секретується клітинами і тому його визначення проводили безпосередньо у культуральному середовищі. Для цього використовували таку схему: через добу після трансфекції змінювали середовище на безсироваткове, на наступну добу середовище повністю відбирали та зберігали при -20 0С, а до клітин додавали свіже середовище без сироватки. Таким чином були відібрані проби культурального середовища на 2-5 добу після проведення трансфекції клітин.
На 2-гу добу після трансфекції Вестерн-блот аналізом було показано наявність АРОА1 людини в культуральному середовищі клітин трансфікованих рекомбінантними плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-IAapo (рис. 2).
Встановлено, що рівень синтезу АРОА1 клітинами, трансфікованими плазмідою pTRhCMV-IAapo, складає ~ 3 нг білка/мл середовища за добу, в той час, як при трансфекції клітин плазмідою pTRhCMV-IEapo – ~ 0,4 нг/мл. Рівень експресії трансгена, що контролюється гібридною послідовністю CAG, був нижчий за чутливість використаного методу аналізу (< 0,2 нг/мл).
Експресія гена АРОА1 стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1. Для порівняння сили промоторів, крім транзиторної експресії трансгена у низці випадків досліджують експресію у пулі стабільно трансфікованих клітин (Xiaetal., 2006). Це дозволяє вилучити з аналізу клітини, в які при трансфекції не потрапив цільовий ген. З іншого боку, оскільки експресія трансгена відбувається з інтегрованих векторних послідовностей її рівень залежить від „ефекту положення”. Для зменшення впливу ефекту положення трансгена на рівень його експресії, досліджується експресія пулом стабільно трансфікованих клітин, а не окремими клонами.
Для дослідження синтезу АРОА1 людини у стабільно трансфікованих клітинах було проведено трансфекцію клітин СНО-К1 препаратами ДНК/ПЕІ з плазмідами: pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoR та pTRhCMV-IAapo neoR. Трансфіковані клітини відбирали на селективному середовищі, яке містило антибіотик G418. Після двох тижнів селективного відбору клітин, які були трансфіковані окремо кожною з плазмід, отримано не менш ніж 100 клонів стабільно трансфікованих клітин.
Оскільки селекцію клітин після трансфекції проводили лише за геном neoR, важливо було встановити наявність гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах. Наявність трансгена визначали в пулі трансфікованих клітин ампліфікацією з різної кількості тотальної ДНК. При цьому визначали мінімальну кількість тотальної ДНК, продукт ампліфікації якої ще виявляли за допомогою електрофорезу. Встановлено, що різні пули стабільно трансфікованих клітин містять приблизно однакову кількість копій АРОА1 людини на клітину (рис. 3).
Для порівняння рівня експресії трансгена з різних регуляторних елементів у пулах стабільно трансфікованих клітин у чашки Петрі переносили по 1·106 клітин, отриманих для кожної з одержаних рекомбінантних плазмід. Через добу середовище замінювали на безсироваткове, а через дві доби відбирали для аналізу. Аналіз проводили для пулів стабільно трансфікованих клітин (надалі стабільно трансфіковані клітини). Вміст АРОА1 у культуральному середовищі визначали методом ELISA (рис. 4).
Кількісний аналіз вмісту АРОА1 у культуральному середовищі проводили також Вестерн-блот аналізом (рис. 5). Встановлено, що рівні експресії гена АРОА1 людини клітинами, трансформованими pTRhCMV-IEapo neoR, pTRCAGapo neoRта pTRhCMV-IAapo neoR, становили 156 нг/мл, 253 нг/мл та 634 нг/мл, відповідно. Одержані результати свідчать, що стабільно трансфіковані клітини СНО-К1, які були отримані для плазмід pTRCAGapo neoR та pTRhCMV-IAapo neoR, забезпечують вірогідно вищий рівень синтезу трансгена, порівняно з рівнем отриманим для pTRhCMV-IEapo-neoR.
Аналіз тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини invivo. Важливим етапом при розробці генно-терапевтичних підходів до корекції генетичних дефектів людини є проведення експериментів на тваринах для встановлення таких характеристик системи доставки трансгена, як специфічність, ефективність, безпечність та інші.
Виходячи з результатів, одержаних на культурі СНО-К1, плазміда pTRhCMV-IAapo забезпечує найвищий рівень експресії гена АРОА1 людини порівняно з іншими сконструйованими нами плазмідами. Однак, із даних літератури відомо, що характер експресії з промоторів може відрізнятись для різних типів клітин, та для досліджень in vitro та in vivo (Xuetal., 2001; Xuetal., 2002). Тому, проводити вибір рекомбінантної плазміди для розробки підходу до ГТ атеросклерозу можливо лише після досліджень in vivo. Крім того, невідомо, який рівень експресії цільового білка можливо забезпечити запропонованим нами методом генно-терапевтичної корекції дефіциту АРОА1 людини in vivo та чи достатній цей рівень для отримання очікуваного терапевтичного ефекту. Тому перші експерименти на тваринах in vivo нами проводились з метою дослідження як характеристик запропонованої нами системи доставки трансгена (тривалість зберігання трансгена, його локалізація в організмі), так ідля вивчення можливого рівня експресії гена АРОА1 людини в організмі кролів та здійснювався з використанням базової плазміди – pTRhCMV-IEapo.
Для дослідження тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини, в організм піддослідних тварин ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат плазміди pTRhCMV-IEapo. При цьому кількість плазмідної ДНК, яку вводили тваринам (щур – 100 мкг, кріль – 240 мкг), була максимально можлива для цього методу, та обмежена сумарним об’ємом препарату, який можливо ввести в паренхіму печінки тварин без видимих її пошкоджень. Тривалість зберігання трансгена в організмі аналізували за його наявністю у фракції тотальної ДНК тканин печінки через різні проміжки часу після введення плазміди pTRhCMV-IEapo. Аналіз проводили методом «nested» ПЛР з використанням пар праймерів Ap-f/Ap-r, Ap(n)-f/Ap(n)-r та Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r, Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r), розрахованих нами для виявлення ДНК АРОА1 людини на фоні тотальної ДНК клітин щура та кроля, відповідно (Гільчук та співав., 2006).
Ген АРОА1 людини виявлено в клітинах печінки всіх щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу після ін’єкції, у той час, як при подальшому аналізі на 90-у добу, трансген не виявлений в усіх проаналізованих тварин (табл. 1). Одержаний результат може свідчити про те, що у зазначений період часу після ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ відбуваються процеси, що призводять або до зменшення у клітинах плазмідної ДНК до рівня, який нижчий за чутливість методу аналізу, або до загибелі трансфікованих клітин. Варто зазначити, що в усіх випадках трансген виявляли лише за результатом другого раунда ампліфікації, однак при цьому спостерігали гетерогенність проб за кількістю синтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту першого раунда ампліфікації.
Таблиця 1
Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки щурів, визначена методом «nested» ПЛР
| Кількість тварин | Час, що пройшов післяін’єкції, доба | ||||
| 3 | 6 | 15 | 25 | 90 | |
| У ДНКяких виявлено цільовий ген | 2 | 3 | 2 | 2 | 0 |
| Загальна | 2 | 4 | 3 | 2 | 3 |
Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітин печінки кролів виявило тривале збереження цільової ДНК в клітинах (табл. 2). Так, трансген виявляли і на 85-у добу після введення ДНК, в той час, як на 150-у добу АРОА1 людинине детектували. Через годину після введення плазмідної ДНК у паренхіму печінки трансген був детектований у першому раунді «nested» ПЛР, в той час, як в усі наступні часові періоди його наявність детектували за продуктами другого раунда ампліфікації. При цьому не спостерігали значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, що можна значною мірою пояснити особливістю аналізу наявності гена АРОА1 людини саме з використанням пар праймерів Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r та Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r: було показано інгібування другого раунда ПЛР з використанням прймерів Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r при більшій за 106 кількості копій цільової ДНК у реакційній суміші.
Таблиця 2
Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки кролів, визначена методом «nested» ПЛР
| Кількість тварин | Час, що пройшов після ін’єкції, доба | |||||
| 1/24 | 6 | 14 | 30 | 85 | 150 | |
| У ДНК яких виявлено цільовий ген | 1 | 3 | 1 | 1 | 3 | 0 |
| Загальна | 1 | 3 | 1 | 1 | 3 | 2 |
Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідних тварин проводили на щурах та кролях, яким ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат ДНК/ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу після ін’єкції плазміди pTRhCMV-IEapo. Для проведення аналізу відбирали у щурів проби тканин печінки, серця, легенів та нирок, а у кролів, окрім цих органів − також лімфатичні вузли та стінку аорти.
За допомогою підібраних для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, що була виділена з тканин різних органів щурів та кролів. За результатами другого раунда «nested» ПЛР встановлено наявність трансгена в усіх проаналізованих зразках тканин тварин (табл. 3) (чутливість «nested» ПЛР у присутності ДНК щура 10 копій гена АРОА1 людини/500 нг ДНК, у присутності ДНК кроля − 103 копій гена/500 нг ДНК). Це свідчить про ефективність доставки плазмідної ДНК ін’єкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ/ДНК.