Прогрессивная петербургская профессура пошла навстречу страстному стремлению Николая Ивановича и подняла в 1839 году вопрос о приглашении его на кафедру хирургии в, Медико-хирургическую (Военно-медицинскую) академию. Много старался об этом Юрьевский приятель Пирогова, друг В. А. Жуковского, профессор К. К. Зейдлиц. Но переходу Пирогова в Петербург долго противился министр просвещения Уваров — в значительной степени вследствие недовольства резкостью молодого профессора в его отношениях с реакционным начальством.
Настойчивость Пирогова, вмешательство влиятельных петербургских профессоров, понимавших значение для науки перехода Николая Ивановича в Петербург, одолели упрямство Уварова. В январе 1841 года Н.И. Пирогов был утвержден профессором Медико-хирургической академии. Весной он переехал в столицу.
Общество столичных врачей, насчитывавшее в своём составе многих заслуженных и учёных медиков с известными именами, устроило Пирогову торжественную встречу. Группа старых профессоров Медико-хирургической академии, видевшая в нём главным образом конкурента по частной медицинской практике, отнеслась к Николаю Ивановичу неприязненно.
Хотя Николай Иванович страстно добивался перевода в Петербург и профессура в Медико-хирургической академии стоила ему тяжёлой и упорной борьбы, он всё же предъявил начальству военно-медицинского ведомства ряд требований, вытекавших из желания поднять русскую науку на высшую ступень. Он поставил условием своего перехода учреждение в составе академии новой кафедры госпитальной хирургии с хирургической клиникой при ней.
«Облагородить госпиталь, — заявил Пирогов в одной из своих многочисленных записок министерство, — привести его к истинному идеальному назначению, соединить в нём приют для страждущего вместе с святилищем науки можно только тогда, когда практическая деятельность к нему принадлежащих врачей соединена будет с изустным преподаванием при постели больных для учащегося юношества».
Условие было принято. Новая кафедра была учреждена. По плану Пирогова был также создан при Медико-хирургической академии анатомический институт. Это было первое учреждение такого рода нетолько в России, но и во всём мире.
Проект Пирогова встретил сильное противодействие со стороны отсталых профессоров. Но автор проекта был человек целеустремлённый и настойчивый в осуществлении намеченного им. Николай Иванович добился учреждения Анатомического института. Конференция академии предложила ему быть директором нового учреждения.
Пирогов принял эту должность, но тоже на определённых условиях. «Самою высшей для меня наградой, — писал он в заявлении на имя конференции, — я почёл бы убеждение, что мне удалось доказать нашим врачам, что анатомия не составляет, как многие думают, одну только азбуку медицины, которую можно без вреда забыть, когда мы научимся кое-как читать по складам; но что изучение её так же необходимо для начинающего учиться, как и для тех, которым доверяется жизнь и здоровье других».
Мысль Пирогова работала в различных направлениях, сводившихся к определенной цели — усовершенствованию науки, распространению в отечестве передовых знаний, применению новейших достижений науки при лечении больных.Пирогов хотел поставить отечественную медицину на большую высоту. Но условия работы противоречили стремлениям этого убеждённого 'новатора науки. Под его клинику были отведены, по словам официального историка академии, очень ветхие, крайне неудобные здания, не отвечавшие самым снисходительным требованиям гигиены. Во многом, самом необходимом, они уступали арестантскому отделению госпиталя. Такими были и другие помещения, отведённые новому профессору. Николай Иванович упорно добивался изменения этой обстановки.
Профессор Пирогов был силён не только в самокритике, он выступал с самой резкой и обстоятельной критикой положения вещей в Медико-хирургической академии, обличал плохую постановку дела в военно-санитарном ведомстве вообще.
Чиновникам это пришлось, не по нраву и не по обычаям. Они привыкли присваивать значительную часть средств, отпускаемых из государственной казны для лечения больных и подготовки врачей, считали, что госпитальное имущество и все продукты составляют их личную собственность, и вступили в жестокую борьбу с неугомонным новатором и нарушителем их воровских традиций. Наглость чиновников дошла до того, что они пытались официально объявить гениального учёного сумасшедшим. Но Пирогов был силён в борьбе правотой и сознанием огромной пользы своей научно-практической деятельности для отечества.
Враги Николая Ивановича были посрамлены и вынуждены на коленях в торжественной обстановке просить у него извинения за клеветнический навет. Однако они продолжали пользоваться всякой оплошностью Пирогова, пренебрегавшего формальностями в своих сношениях с бюрократическим начальством, и мешали ему спокойно работать. Пытались также предать его суду за нарушение канцелярских правил при выписке лекарств для клиники и т. п.
Всё это было безуспешно, хотя в борьбе с Пироговым канцелярские чиновники имели поддержку некоторых профессоров, отсталых в научном отношении, равнодушных к постановке преподавания и подготовке врачей, но весьма ревностных в получении доходов от медицинской практики. А доходам этих профессоров — хирургов и не хирургов — угрожал большой ущерб.
Николай Иванович приехал в Петербург с репутацией чудесного доктора. Его врачебная практика увеличивалась со дня на день. К нему приходили больные с самыми разнообразными недугами. В числе его пациентов были люди всех классов и всех слоев населения—от полунищих крестьян из пригородов до членов царской семьи. Полнейшая доступность знаменитого профессора, простота его, редкое бескорыстие, доброта и ласковость в обращении с детьми привлекли к нему общую любовь и создали огромную известность.
Свою врачебную практику Пирогов рассматривал не как источник дохода, а как помощь страждущим и материал для изучения происхождения болезней, для борьбы с ними.
В труде Пирогов был неутомим. Кроме многочисленных и сложных обязанностей по Медико-хирургической академии. Николай Иванович взял на себя в Петербурге много других работ. Он был директором инструментального завода военно-медицинского ведомства — руководил научной стороной изготовления и усовершенствования инструментов для всех хирургических учреждений страны. Был бесплатным консультантом во всех крупных больницах и лечебницах столицы. Деятельно работал в учебных медицинских советах и комиссиях военного и гражданского ведомств. Составлял программы преподавания по медицине для университетов и других учебных заведений, правила для экзаменов врачей и студентов и т. п. Часто исполнял поручения военного ведомства по инспектированию госпиталей в различных концах страны — от Финляндии до Кавказа.
Пирогов был одним из глазных и самых видных деятелей научной и практической медицинской жизни тогдашней России. Популярности Николая Ивановича содействовали его многочисленные слушатели, восхищавшиеся разнообразными талантами своего профессора. На лекции Пирогова приходили не только студенты тех курсов академии, которым полагалось сдавать экзамены по его предметам, но слушатели всех других отделений. В Медико-хирургической академии в часы лекций Николая Ивановича пустовали аудитории других профессоров. По их жалобам начальство предписало студентам посещать лекции Пирогова и практические занятия у него только в часы, свободные от других лекций. Научная деятельность Пирогова в петербургский период его профессуры была так же значительна, как и в Юрьеве. За это время Николай Иванович сделал 69 научных сообщений в столичном обществе практических врачей. Кроме этого общества, Николай Иванович делал научные доклады в Пироговском кружке. Это было частное собрание нескольких наиболее видных по положению и научным заслугам петербургских врачей, объединившихся вокруг молодого профессора Медико-хирургической академии и назвавших свой кружок его именем. Согласно протокольным записям кружка, он имел за шесть лет сто заседаний. Николай Иванович не был только на последних шести заседаниях за отъездом в 1854 году в Крым. Он сделал в кружке 141 доклад на самые различные темы из всех отделов медицины. Другие участники кружка не были так продуктивны: самый работоспособный из них сделал в кружке 82 доклада.
В академической клинике Пирогова, по данным историка его кафедры, было произведено за 1843—1854 годы 1140 хирургических операций, в среднем по 104 операции в год, с подробными научными описаниями их. Кроме того, лично Пироговым или под его руководством произведено много тысяч операций в Обуховской и других столичных больницах,
где он был консультантом. Сам Николай Иванович произвёл за эго время около 12 тысяч вскрытий трупов с подробным описанием каждого.
За время своей петербургской научно-исследовательской и преподавательской деятельности Пирогов напечатал несколько капитальных трудов и много небольших по объёму, весьма содержательных монографий и журнальных статей.
Из основных трудов Николая Ивановича в период его петербургской профессуры первым стал печататься «Полный курс прикладной анатомии человеческого тела с рисунками. Анатомия описательно физиологическая и хирургическая». Курс не был закончен печатанием вследствие банкротства издателя. Не дошла до нас и рукопись Пирогова.
Пять тетрадей «Прикладной анатомии» (25 листов рисунков с текстом) было представлено в 1844 году в Академию наук, на конкурс по присуждению Демидовских премий. Отзыв о сочинении дали академики эмбриолог КМ. Бэр и зоолог Ф. Ф. Брандт. Они писали, что труд Пирогова даже в неоконченном виде представляет большую научную ценность и превосходит по значению новейшие зарубежные работы такого рода.