Исследование о холере было представлено в Академию наук на Демидовский конкурс 1851 года. В отчёте академии о присуждении Демидовских премий указывается, что задача Пирогова, взятая на себя, — «одна из самых трудных». Она «требует от наблюдателя сверх неутомимого пристального вглядывания в болезнь, ещё необыкновенной силы характера и ничем не нарушимого хладнокровия». Но подготовленный к такому делу исследователь «проникнет далее других в самые сокровенные тайники» болезни. «Это в полной мере можно сказать о сочинении Пирогова, именем которого уже не впервые украшаются летописи Демидовского конкурса».
При обработке своего труда Пирогов использовал методы химического исследования. Как заявляет рецензент Академии наук, Николай Иванович выполнил это «с той же самой деятельностью и настойчивостью», которым читатели привыкли «удивляться» во всех его трудах.
О приложенном к тексту атласе в 16 таблиц большого формата автор разбора пишет, что здесь Пироговым и работавшими под его «собственным надзором» художниками Мейером и Теребеневым достигнута «крайняя степень совершенства».
Подлинные рисунки к пироговскому атласу азиатской холеры сохранились до наших дней. Получивший их от вдовы профессора С. С. Боткина и передавший в ленинградский музей Пирогова профессор Ф. И. Валькер удостоверяет, что эти рисунки, имеющие почти столетнюю давность, поражают живостью своих красок и необычайной художественностью исполнения.
Венцом петербургских анатомических исследований Пирогова является его классическая «Топографическая анатомия», называемая по изобретённому её автором методу «Ледяной анатомией».
«Топографическая анатомия» вся построена на исследовании замороженных трупов. Здесь Пирогов проявил гениальность учёного, творческую фантазию мыслителя, изобретательский талант новатора, тонкую наблюдательность художника. Сам Николай Иванович оставил в «Дневнике старого врача» интересное заявление о роли фантазии в научном творчестве: «Без фантазии и ум Коперника и Ньютона не дал бы нам мировоззрения, сделавшегося достоянием всего образованного мира, Ничто великое в мире не обходилось без содействия фантазии».
Исследование Пирогова начато печатанием в 1851 году и закончено в 1859 году. Выходило оно частями в виде атласа на листах большого формата, с отдельными тетрадями объяснительного текста. Четырёхтомный атлас состоит из 224 таблиц, на которых представлено 970 распилов в натуральную величину, рисованных художниками под наблюдением автора. Объяснительный текст—на латинском языке— состоит из четырёх тетрадей большого книжного формата.
Сокращённое изложение текста «Топографической анатомии» напечатано в распространённом журнале «Отечественные записки» (1860 год). Николай Иванович излагает в этой статье основные принципы своего труда. Как во всей своей исследовательской деятельности, он и здесь имел в виду главным образом приложения научных открытий к практической медицине.
«Я видел на моём веку,— пишет Пирогов,— много врачей, которые, зная порядочно обыкновенную описательную анатомию, имели чрезвычайно сбивчивое понятие о положении желудка и ободошной кишки, и при исследованиях живота у больных постоянно смешивали положение этих двух частей кишечного канала... В начале 1850 г. я, к полному осуществлению моей мысли, решил издать полное систематическое изложение разрезов всего тела... Меня поддерживала мысль, что придуманным мною способом я мог изложить с неизвестной доселе точностью положение всех частей тела...
Господствующая мысль моего труда проста. Она состоит в том, чтоб посредством значительного холода, равняющегося не менее как 15° R, довести все мягкие части трупа до плотности твердого дерева... Доведши труп до плотности дерева, я мог и обходиться с ним точно так же, как с деревом; мне нечего было опасаться ни вхождения воздуха по вскрытии полостей, ни распадения их. Я мог самые нежные органы распиливать на тончайшие пластинки. Мне нужно было исследовать положение частей в трёх главных направлениях: в поперечном, продольном и переднезаднем, и я распиливал каждую полость на верхнюю и нижнюю, на правую и левую и на переднюю и на заднюю половины...
Во время моих занятий я напал на мысль сделать ещё другое приложение холода к топографической анатомии. Мне представилась возможность посредством заморожения изучить положение, форму и связь органов, не распиливая их в различных направлениях, а обнажая их на замороженном трупе, подобно тому, как это делается и обыкновенным способом. Конечно, этого нельзя сделать без помощи долота, молотка, пилы и горячей воды. Подобно тому как в Геркулане открывают произведения древнего искусства, залитые оплотневшею лавою, так точно нам нужно в замороженном трупе обнажать и вылущать органы, скрытые в оледеневших слоях».
Дальше следует рассказ о том, как Пирогов еще в 1853 году представил в Парижскую академию пять выпусков своего атласа "опа-графической анатомии». Об этом труде русского учёного было сделано в заседании Французской академии 19 сентября того же года сообщение, напечатанное в её протоколах. Спустя три года французский анатом Ле-жаyдр представил в Парижскую академию несколько таблиц, выполненных по тому же методу сечения замороженных трупов, и получил Монтионовскую премию.
Об этом было напечатано в тех же протоколах той же академии, но о Пирогове здесь не упоминалось. «Мой труд как будто бы не существовал для академии», — пишет Николай Иванович и добавляет иронически, намекая на Крымскую войну: «Я ничем другим не могу объяснить это забвение, как восточным вопросом, в котором вероятно и парижская академия, по чувству патриотизма, приняла деятельное участие. Но оставим в покое вопрос о первенстве. Нужно решить сначала, стоит ли о нём спорить и принесли ли исследования замороженных трупов хоть какую-нибудь пользу науке». Ответ на это дала наша Академия наук, присудившая в 1880 году Пирогову за «Топографическую анатомию» полную Демидовскую премию.
Зимой 1851 года Пирогов изложил на лекции в Медико-хирургической академии новый способ костно-пластической операции ноги. В следующем году сообщение об этом появилось в печати. Одна идея костно-пластической операции могла бы, по заявлению многих авторов, обессмертить имя Пирогова, если бы у него не было других заслуг перед наукой и человечеством. Её достоинство, как определял сам Николай Иванович, не только в способе ампутации (вырезание повреждённого органа), а в остеопластике. «Важен принцип,— пишет он в «Началах военно-полевой хирургии», — что кусок одной кости, находясь в соединении с мягкими частями, прирастает к другой и служит и к удлинению, и к отправлению (действию) члена».
Операция Пирогова описывается в учебниках хирургии всего мира, ей отведено значительное место в энциклопедиях и других справочниках. Однако признание она получила не сразу. За рубежом отнеслись к идее русского учёного отрицательно. «Между французскими и английскими хирургами есть такие, — писал Пирогов в 1865 году,— которые не верят даже в возможность остеопластики, или же приписывают ей недостатки, никем кроме них самих
не замеченные; беда, разумеется, вся в том, что моя остеопластика изобретена не ими». Остеопластическая операция Пирогова постепенно завоевала всеобщее признание.
Еще при жизни Пирогова швейцарские, немецкие, американские, наконец, прежние противники остеопластики — французские хирурги — признали достоинства идеи русского учёного и сообщали о десятках случаев счастливого исхода операции по его способу. В наше время её делают гораздо чаще, чем во времена Пирогова.
Большое значение для характеристики Пирогова, как учёного гражданина и честного наставника, имеют его работы «Об успехах хирургии в течение последнего пятилетия» (1849 год), «Отчёт о хирургических операциях с сентября 1852 по сентябрь 1853 гг.», «О трудности распознавания хирургических болезней и о счастий в хирургии, объясняемых наблюдениями и историями болезней» (1854 год). В последней, довольно обширной, монографии Николай Иванович обращал внимание медицинской администрации и общества на то, что требование счастливого результата операции от молодых хирургов может принести пагубный вред больным. Желание показать товар лицом «побуждало бы врачей скрывать истинную историю болезни и заставило бы, в погоне за более удачным результатом, выписывать больных возможно скорей, как бы излеченных». Пирогов настаивал на научном исследовании болезни. Он приводит примеры «трудностей, встречаемых тем, кто без... дипломатии и без суеверия, на пути чисто учёном, хочетбыть счастливым врачом и оператором». Излагает случаи, интересные для поучения начинающих врачей. Сообщает примеры из своей практики, где «только верности распознавания» больной «обязан тем, что не лишился жизни под ножом».
Пирогов заявляет, что только осторожное и внимательное исследование приводит к счастливым результатам. Это, однако, не значит, что врач должен стоять у кровати больного «робко и недоверчиво». Успех достаётся врачу смелому и решительному, но только в том случае, если он не ограничивается изучением одной избранной им узкой специальности. «Нужно... обращать на всё самое тщательное внимание и ни малейшей вещи не оставлять без исследования».
Упорно и настойчиво борясь с защитниками устарелых научных взглядов, с противниками движения вперёд, Пирогов не щадил также ничьих самолюбий, не считался с положительными сторонами деятельности своих противников, с их заслугами перед наукой, с их человеческими слабостями. Это создало ему, кроме массы врагов в мелочной чиновной среде, много недругов в профессорских и врачебных кругах.