Метод основан на скорости вымывания предварительно введенного водорода из мозговой ткани и позволяет определить объемную скорость мозгового кровотока. Положительными сторонами метода являются отсутствие травматизации сосудов мозга, стабильность показателей, индифферентность используемого газа.
На основе водородного клиренса регистрировали мозговой кровоток на наркотизированных крысах. Результаты оценивались по кривой изменения напряжения водорода на электроде полярографическим способом [10, 30, 59, 194, 195].
2.3 Регистрации параметров кардиогемодинамики с помощью компью-терной программы «Bioshell» на бодрствующих животных
Опыты проводились на белых крысах. Предварительно за 24 часа до начала эксперимента (хлоралгидрат 300 мг/кг, внутрибрюшинно) имплантировали полиэтиленовый катетер через правую сонную артерию [196]. Периферический конец катетера подкожно выводили на холку животного и фиксировали. Регистрацию данных производили с использованием одноразовых датчиков SP-01 (США) и компьютерной программы «Bioshell» в реальном масштабе времени на базе персональных компьютеров IBM AT 486 и Pentium-133 [197]. Анализировали следующие параметры кардиогемодинамики:
- артериальное давление
- частоту сердечных сокращений.
2.4 Методика оценки поведения животного в тесте «открытое поле»
Оценку влияния исследуемых соединений на ориентировочно исследовательскую и двигательную активность животных проводили в тесте «открытое поле». Предложенный Холлом метод "открытого поля" широко применяется в различных экспериментальных исследованиях, связанных с изучением поведения, психофармакологией.
Установка представляет собой круг диаметром 80 см, с бортиком 20 см, разделённый на 8 радиальных секторов и одним в центре. Тестируемое животное помещали в центральный сектор, спиной к экспериментатору. В течение 3 минут наблюдения регистрировали число пересечённых секторов (двигательная активность), вставание на задние лапы и число пересечённых центральных секторов (ориентировочно-исследовательская активность), количество стереотипных движений (груминг), эмоциональную активность (дефекация, уринация) [192, 198, 199, 200, 201].
2.5 Оценка координации движений
Координацию движений крыс оценивали в тесте вращающегося стержня. Крыс помещали на горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 об/мин. Неспособность животных удерживать равновесие на стержне в течение трёх минут рассматривали как проявление нарушения координации движений [192, 202].
2.6 Методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ)
Данная модель предназначена для изучения процессов связанных с воспроизведением памятного следа. Оценку антиамнестического эффекта проводили по измерению латентного периода захода животного в тёмный отсек при воспроизведении навыка УРПИ. Выработку условной реакции пассивного избегания затемнённого отсека производили в экспериментальной камере, которая состояла из двух смежных отсеков, большого освещенного 60 на 60 см, и малого затемнённого (15х15см), снабжённого электродным полом.
Отсеки сообщались между собой с помощью четырёхугольного отверстия (8х8см). Крысу помещали на середину площадки светлого отсека, хвостом к тёмному отсеку и в течение трёх минут регистрировали латентный период первого захода в тёмный отсек. Животных, не заходивших в тёмную камеру, по истечение трёх минут из опыта исключали.
В тёмном отсеке животное получало через электрический пол однократное электроболевое раздражение электрическим током (40 в), состоящее из трёх импульсов длительностью 1 сек, следующих с интервалом 0,5 сек. Крыса считалась обученной, если в течение 30 сек после сеанса обучения она не заходила в тёмный отсек экспериментальной камеры. Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 24 часа после обучения при повторном помещении животных в светлый отсек камеры и регистрации в течение трёх минут латентного периода первого захода в тёмный отсек, количества заходов и общего времени пребывания в тёмном отсеке. В модификации Буреш, Бурешова выработку условной реакции пассивного избегания затемнённого отсека также производили однократным электроболевым раздражением электрическим током (40 в), состоящим из 12 импульсов длительностью 1 сек, следующих с интервалом 5 сек. в течение минуты. Модификация Буреш, Бурешова позволяет судить о влияния исследуемых соединений на процесс фиксации обучения и консолидацию памяти (переход кратковременной памяти в долговременную) поскольку обучение проводили после ишемии, а также о степени неврологических нарушений, животных перенесших тотальную ишемию мозга, т.к. способ обучения не требует абсолютной выработки рефлекса избегания [192, 203].
2.7 Методы изучения противогипоксической активности
Для создания патологического фона, на котором изучалась эффективность исследуемых соединений, использовались различные модели циркуляторных гипоксий.
Нормобарическая гипоксия с гиперкапнией (т.н. «баночная гипоксия») является наиболее простым методом оценки антигипоксической активности. Животных одинакового веса (разброс не более 2 г на группу) помещали в герметически закрытые (крышки смазывали вазелином) банки 750 см3. Во всех случаях регистрировали время выживания (смерти) животных [202].
Циркуляторную гипоксию воспроизводили путём перевязки двух передних общих сонных артерий. Операция проводилась в асептических условиях с использованием наркоза хлоралгидрат, внутрибрюшинно, 300 мг/кг массы тела. За оперированными животными наблюдали в течение 3 суток с регистрацией числа выживших животных в опыте и контроле [192].
Следующую модель ишемии мозга создавали критическими гравитационными перегрузками в кранио-каудальном положении животных. Известно, что продольные гравитационные перегрузки, создаваемые центрифугой, вызывают нарушения кровоснабжения головного мозга, степень и характер которых зависит от величины и вектора ускорения.
Крысы помещались в отдельные продольные ячейки, объём ячеек соответствовал размеру животных и не давал возможности самопроизвольно отклоняться от заданного вектора ускорения.
Центрифуга представляет собой мотор с приводом установленный на станине. К приводу сверху крепится коромысло длиной 2,0 м, по краям которого расположены камеры для животных. Также имеется пульт управления, позволяющий контролировать число оборотов, градиент нарастания и спада перегрузок [204].
2.8 Методика воспроизведения постишемических цереброваскулярных феноменов
Для оценки действия исследуемых препаратов на динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов воспроизводили ишемию мозга путем двухсторонней окклюзии сонных артерий в течение 10-12 мин. при снижении САД до 40 мм рт.ст. После ишемии и реинфузии крови в артериальную систему животного осуществляли регистрацию скорости МК методом клиренса водорода [10, 30, 59, 194, 195].
2.9 Условия экспериментальных исследований
Экспериментальные исследования проведены на 236 крысах массой 200 -250 г обоего пола и 154 белых мышах массой 20-25г обоего пола. Исследовали неорганические производные селена: селенит натрия, селенит цинка.
В связи с тем, что селенит натрия и селенит цинка легкорастворим в воде в экспериментах использовали водные растворы. Растворы веществ готовили добавлением при перемешивании физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида).
2.10 Статистическая обработка данных
В таблицах диссертации данные представлены в виде средних арифметических и ошибки среднеквадратичного отклонения. Исходные данные приведены в абсолютных значениях, а изменения, которые произошли после введения препаратов, приведены в процентном отношении к исходным показателям. Статистическую обработку полученных результатов производили по критерию Стьюдента [192]. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05, р<0,01 для парных выборок по критерию Стьюдента.
ГЛАВА 3 ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНИТА НАТРИЯ И СЕЛЕНИТА ЦИНКА НА ЦЕРЕБРАЛЬНУЮ ГЕМОДИНАМИКУ, СИСТЕМНОЕ АРТЕРИАЛЬНОЕ ДАВЛЕНИЕ И ЧАСТОТУ СЕРДЕЧНЫХ СОКРАЩЕНИЙ УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НОРМЫ
Острые опыты проведены на 90 мышах массой 20 – 22 г и 48 крысах массой 200 – 250 г. Регистрацию объёмной скорости мозгового кровотока осуществляли методом водородного клиренса. Системное артериальное давление и частоту сердечных сокращений у бодрствующих животных проводили с использованием одноразовых датчиков SP-01 (США) и компьютерной программы Bioshell. Исследуемые вещества вводили в дозах 30, 50, 100 мкг/кг внутрибрюшинно.
3.1 Изучение острой токсичности исследуемых соединений
Определение острой токсичности селенита натрия, селенита цинка и расчёты LD50 проводили по методу Кербера. Белым мышам (90 особей) массой 20-22 г, обоего пола селенит натрия и селенит цинка вводили в 0,5 мл изотонического раствора внутрибрюшинно в дозах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 мг/кг. Наблюдение за поведением и состоянием подопытных животных проводилось в течение 7 суток, при этом отмечали изменение внешнего вида, поведенческих реакций и количество погибших животных. Контрольной группе животных (10 особей) вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
LD50 рассчитывали по формуле:
LD50 = LD100 – Σ (Z*D)/m, где
Σ – сумма.
Z – половина суммы числа животных павших от двух последующих доз;
D – интервал между каждыми двумя последующими дозами;
m – число животных на каждую дозу;