Иммуноанализ методом подсчета частиц (стр. 2 из 2)

Во втором исследовании показана возможность применения метода для измерения очень низких концентраций белков. В тиро-идной эндокринологии постоянно ощущается потребность в высокочувствительных методиках определения тироидстимулирующего гормона. Такие методики позволяли бы надежно отличать больных тиротоксикозом, а также микседемой от здоровых людей. Более того, при острых эутотироидных синдромах такие методики менее проблематичны, чем определение свободного тироксина, поскольку на их результаты не влияют посторонние вещества, часто присутствующие в сыворотке больных, страдающих этими заболеваниями.

На рис. 8 представлена схема первого гомогенного высокочувствительного метода определения TSH; благодаря одночасовой инкубации это самый быстрый из описанных до настоящего времени методов определения TSH в сыворотке человека. В нем используются два типа моноклональных антител на различных латексах. Предел обнаружения и калибровочная кривая представлены на рис. 9.

Предварительные результаты исследования сыворотки группы здоровых людей и группы больных тиротоксикозом представлены на рис. 10. Результаты анализа позволяют четко различить эти две группы. В гипертироидной группе оказался один пациент с Т₃-токсикозом, у которого концентрация TSH превысила предел обнаружения. Тироидный статус этого пациента точно неизвестен.

Аналогичные результаты определения TSH позднее были получены методом радиоиммуноанализа с набором реагентов BehringHS-TSH. Вероятно, этот пациент ошибочно был включен в группу больных тиротоксикозом.

5. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА

Из приведенных выше данных видно, что определение TSH в сыворотке человека с помощью метода IMPACT позволяет в 10 -1000 раз повысить чувствительность по сравнению с турбидимет-рическим иммуноанализом с латексной агглютинацией. По чувствительности описанный метод сравним с иммунорадиометрическим анализом и превосходит флуоресцентный, хемилюминес-центный или ферментный иммунометрические методы анализа.

Как показано на рис. 11, в методе IMPACT -используется избыток антител. Однако по своим характеристикам метод IMPACT располагается скорее между собственно иммунометриче-скими методами и конкурентным иммуноанализом, причем связывание антигена с антителом, возможно, усиливается за счет множества слабых взаимодействий.

Физические основы метода сложны и пока еще не до конца изучены. Чувствительность анализа определяется: 1) числом частиц, 2) поверхностной плотностью антител или антигена, 3) константой связывания антител, 4) возможно, псевдоконстантой связывания антител, 5) погрешностью Пуассона при подсчете частиц в потоке, проходящем через ячейку.

Чувствительность метода можно увеличить примерно в 100 раз, если подсчитывать агглютинированные частицы. При этом должна также устраняться компонента погрешности Пуассона, обусловленная фоном неагглютинированных частиц. Подсчет агглютинированных частиц довольно сложен. Относительное содержание определяемых димеров, тримеров, тетрамеров и высших олиго-меров зависит от природы изучаемого вещества и от его концентрации. Прототип детектора с высокой разрешающей способностью разработан фирмой AcadeDiagnosticSystems и предназначен для определения альфа-фетопротеина методом IMPACT. Для решения проблемы сложного характера агглютинации детектор, функционируя в кинетическом режиме, определял только димер. Таким путем всего за 4 мин удалось с высокой чувствительностью определить концентрацию димера прежде, чем успели образоваться заметные количества высших олигомеров.

6. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Система IMPACT находится в такой стадии развития, когда уже создана прочная основа для дальнейшего совершенствования путем расширения круга определяемых веществ и разнообразия методик. В этом контексте вырисовываются три основных пути развития системы: 1) определение новых веществ, 2) совершенствование химических процессов, 3) совершенствование приборов.

Определение новых веществ. Широкая сфера применения метода позволяет использовать его для определения практически любого нового вещества. В настоящее время разрабатываются методики определения антигенов вируса иммунного дефицита человека и антител к нему, факторов коагуляции, специфических аллергенов. Пока еще не изучалась возможность определения веществ с помощью специфических связывающих белков, а не антител. В принципе систему IMPACT можно использовать и для определения веществ с помощью таких связывающих белков.

Совершенствование иммунохимических процессов. Применение моноклональных антител, например при определении TSH, повышает специфичность. Устранить побочные эффекты, связанные с избытком антигена, можно путем соответствующего картирования эпитопов. Ожидается, что метод может найти применение и в молекулярной биологии.

Совершенствование приборов. В середине 1987 г. фирмой AcadeDiagnosticSystemS.A. начат выпуск новой компактной модульной полуавтоматической системы MULTIPACT. Она состоит из высокопроизводительного счетчика частиц, термостата и устройства для добавления и разбавления проб и растворов реагентов. Будут выпускаться также наборы реагентов для определения следующих 6 веществ: Т₄, Т₃, тирок-синсвязывающего глобулина, TSH, дигоксина и c-hCG. В наборах для определения TSH и /?-hCG используются моноклинальные антитела.

Аналогичные системы третьего поколения, вероятно, будут обладать большей производительностью, способностью быстро работать в кинетическом режиме и определять агглютинированные частицы.

ВЫВОДЫ

После сравнительно длительного периода становления иммуноанализ с подсчетом частиц достиг такого состояния, когда 1) его чувствительность не уступает чувствительности других лучших конкурентных методов иммуноанализа, 2) на результаты анализа почти не влияют никакие посторонние вещества в пробе, 3) по производительности, дешевизне и степени автоматизации он не имеет себе равных.

Современная промышленность способна производить дешевые полуавтоматические приборы, предназначенные для проведения анализов в небольших лабораториях, а также полностью автоматизированные, быстродействующие анализаторы для крупных клиник или контрольных лабораторий. Более того, отдельные операции могут найти применение и в других системах, например в автоматических клинических анализаторах, работающих на принципе регистрации кинетики турбидиметрии. Представляется вполне вероятным, что система IMPACT или какой-либо ее аналог сыграют одну из важнейших ролей при переходе к методам иммуноанализа без применения радиоактивных изотопов как в клинической диагностике, так и в научных исследованиях.