Поліморфізм ферментів CYP450 відповідальний за певні особливості при лікуванні пацієнтів різних етнічних груп. Наприклад, 7% осіб білої раси га 2-7% осіб негроїдної раси є повільними метаболізаторами препаратів, іалежних від активності CYP 2D6. Один з 5 азіатів є повільним метаболізатором ліків, залежних від CYP2СІ9 (метаболізує фенітоїн, фенобарбітал, омепразол та ін.). Різниця у відповіді на ліки серед етнічних груп також може залежати від інших ферментативних систем метаболізму, переносників та рецепторів.
Цитохром CYP 1А2 бере участь у метаболізмі багатьох ліків, включаючи еуфілін і кофеїн. Активність цього ферменту підвищується під впливом хімічних речовин, що попадають в організм людини під час паління.
Цитохром CYP 2А6 відіграє важливу роль у метаболізмі кумарину (непрямий антикоагулянт) і нікотину.
Цитохром CYP 2С9 втягнутий у метаболізм фенітоїна, толбутаміда, варфарина. Якщо в структурі гена, що кодує синтез даного цитохрома, змінюється хоча б одна амінокислота, то порушується його ферментативна активність. Ферментна недостатність цього цитохрома обумовлює уроджену схильність до інтоксикації фенітоїном і до ускладнень у результаті терапії варфарином.
Цитохром CYP 2С19 бере участь у метаболізмі омепразола, діазепама, іміпраміна. Однак клінічне значення поліморфізму цього ферменту залишається спірним. Ефективні дози багатьох препаратів, метаболізуємих CYP 2С9, настільки далекі від токсичних, що потенційні відхилення в активності цитохрома CYP 2С9 не грають значної ролі.
Цитохром CYP 2 D 6 являє приклад генотипічних розходжень серед різних етнічних груп. У 70-х роках минулого сторіччя вивчали фармакокінетику антигіпертензивного препарату дебрізохіна й антиаритміка спартеїна. Отримано наступні результати: при загальній тенденції до надшвидкого метаболізму дебрізохіна, серед облич європеоїдної раси повільний метаболізм спостерігався в 5–10% випадків, серед японців цей показник склав менш 1%.
Препарати, метаболізуємі CYP2D6 (b-блокатори, антиаритміки, психоаналептики, антидепресанти і наркотичні анальгетики), мають вузький терапевтичний індекс, тобто між дозою, необхідної для досягнення лікувального ефекту, і токсичною дозою існує невелика різниця. У такій ситуації індивідуальні відхилення в метаболізмі ліків можуть зіграти драматичну роль: підвищення концентрації останнього до токсического рівня, або зниження до втрати ефективності.
Історія застосування пергексилина (Австралія) яскраво продемонструвала величезне значення поліморфізму CYP2D6. Після першого досвіду призначень препарат був вилучений з арсеналу засобів для лікування стенокардії унаслідок високої гепато- і нефротоксичності. Але в даний час пергексилин знову застосовується і визнаний високоефективним засобом, оскільки є токсичним тільки для пацієнтів зі слабким метаболізмом CYP2D6. Безпека призначення пергексилина забезпечується попереднім визначенням індивідуального рівня цього цитохрома.
Цитохром CYP 3А4 приблизно метаболизирует близько 60% усіх лікарських речовин. Це основний цитохром печінки і кишечнику (від загальної кількості цитохромів він складає 60%). Активність його може підвищуватися під впливом ріфампіцина, фенобарбітала, макролідів і стероїдів.
3.1. Значення індукції ферментів.
Відомо, що ще в стародавності Митридат систематично приймав невеликі дози отрут, щоб уникнути гострого отруєння. "Ефект Митридата" заснований на індукції визначених захисних систем: фенобарбітал индуцирует систему цитохрома Р-450, глутатион- і Удф-глюкуронілтрансферази і епоксидгідролази; дибунол (бутилокситолуол) і бутилоксианізол - ці ж трансферази і ферменти синтезу глутатиона; протиракові ліки - Р-глікопротеїн і синтез глутатіона; метали викликають нагромадження обох видів єднальних їхніх SH-речовин. У результаті зростає стійкість кліток і організму до отрут і ліків. Так, снотворна дія фенобарбітала поступово усе більше знижується. Курсове уведення фенобарбітала в немовлят збільшує зв'язування і, отже, знешкодження вільного білірубіна при спадкоємному дефекті цієї системи чи гемолитичній жовтяниці [2-5, 10]. При хіміотерапії злоякісних процесів початкова ефективність ліків часто поступово падають, більш того, розвивається множинна лікарська стійкість, тобто стійкість не тільки до цього засобу, але і цілому ряду інших. Речовини, інгибуючі Р-гликопротеин чи його індукцію і ферменти синтезу глутатиона, перспективні для підвищення ефективності хіміотерапії [9].
Одним з найважливіших властивостей компонентів монооксигеназної системи, зокрема цитохрома Р-450, є здатність до індукції під дією зовнішнього стимулу, у ролі якого можуть виступати ксенобіотики, визначені фізичні впливи, стрес. В окремих випадках екзогенні речовини индуцируют ферменти (у тому числі цитохроми Р-450) свого метаболізму, що важливо мати на увазі при прийомі лік, побічною дією яких є індукція ферментів власного метаболізму. Феномен індукції цитохромів Р450 є найважливішою складовою адаптивної відповіді на чужорідні з'єднання, що попадають у клітку. Це приводить до посилення детоксификационної функції організму з наступним виведенням ксенобіотика. Хронічне введення пацюкам барбітуратів поступово зменшувало час сну від цих препаратів через посилення їхнього метаболізму. Звідси був зроблений висновок, що дані метаболічні зміни викликані індукцією визначених форм цитохрома Р450. Процес індукції цитохромів Р450 синтетичними чи природними з'єднаннями зареєстрований у ссавців, птахів, риб, безхребетних, рослинах, дріжджах і бактеріях. Усе це свідчить про біологічну важливість цього явища.Деякі цитохроми P-450 є високо індуцибельними: наприклад, експресія Р-450 1А1 може збільшуватися більш ніж у сто разів у печінці і багатьох інших тканинах під дією 2,3,7,8,-тетрахлородибензо-р-діоксина, 3-метилхолантрена чи інших поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ). Експресія Р-450 2Е1 у печінці зростає під впливом етанола, ацетону, ізоніазида, імідазола й інших речовин, а експресія цитохромів підродини 4А в печінки і нирках викликається клофібратом і іншими пероксисомальними пролифераторами. Ефективними індукторами Р-450 підродини 3А є макролідні антибіотики, синтетичні стероїди (наприклад, дексаметазон), і фенобарбітал (ФБ). ФБ разом з великою групою структурно різних хімічних сполук, може також збільшувати експресію індивідуальних членів підродин підродин цитохромів Р-450 2А, 2В и 2С як у лабораторних тварин, так і в людей (наприклад, індукція цитохромів Р-450 2С під дією ФБ у культурах людських гепатоцитов). Параметри індукції деяких цитохромів Р450 приведені в табл.
Табл. Індукція цитохромів Р450 різними з'єднаннями
Як видно з таблиці, ряд цитохромів Р450 активується при участі специфічних рецепторів. Лише для Р-450 1А1 і, відповідно, Ah-рецептора відомий детальний механізм дії. Для інших Р450, як правило, ідентифікований специфічний рецептор, але механізм дії до дійсного часу детально не описаний. Крім транскрипційного механізму індукції для цитохромів Р450 відомі також посттранскрипционние (стабілізація мРНК) і пострансляционние (стабілізація білка, модифікація ферменту) механізми. Останні характерні для цитохромів Р450 1А2, 2Е1 і 3А1.
Важливість вивчення цитохромів Р450 1А підродини в людини й експериментальних тварин обумовлена їхньою роллю в хімічно індукованому канцерогенезі. Саме ці ферменти здійснюють метаболическую активацію багатьох кацерогенних з'єднань, включаючи поліциклічні ароматичні вуглеводні, гетероциклические аміни, ароматичні аміну й інші з'єднання. У більшості видів ссавців 1А підродина складається з 2-х членів: 1А1 і 1А2 . CYP1A1 не виявляється в нормальній печінці, а експрессируется лише під впливом ксенобіотиків-індукторов, до яких відносяться ПАУ. Цитохроми Р450 1А1 і 1А2 здійснюють біоактивацию наступних прооксидантов і проканцерогенов: Р450 1А1 – бензапірена й інших ПАУ, Р450 1А2 – ПАУ, ароматичних амінів, нітрозоамінів, парацетамола, гетероциклічних амінів.Для CYP1А1 характерний генетичний поліморфізм індуцибельності серед інбредних ліній мишей. Деякі лінії (наприклад, C57Bl/6) чуттєві до індукції ПАУ-з'єднаннями, тоді як інші (DBA/2) не відповідають на введення цих з'єднань.Такий поліморфізм зв'язаний з генетичним локусом Ah (Aryl Hydrocarbon Rесерtоr), що кодує білок, названий Ah-рецептором. З цим білком зв'язується хімічний індуктор. Канцерогенні ПАУ з'єднання, такі як МХ, - типові індуктори CYP1А1.Лігандами для Ah яляются планарні молекули типу ПАУ. Пізніше був знайдений ще більш могутній індуктор, 2,3,7,8- тетрахлордибензо-р-діоксин (ТХДД), здатний через високу афинність до Ah-рецептора викликати індукцію в дозах, на порядок менших, чим для інших ПАУ. Наявність у клітці рецептора для з'єднання, зробленого людиною відносно недавно, залишається загадкою для дослідників. Можливо, що ТХДД мімікрирує якесь ендогенне природне з'єднання, здатне зв'язуватися з Ah-рецептором. Такі з'єднання були знайдені в деяких рослинах. Як показали експерименти з нокаутними мишами, можливо також існування й ендогенного ліганда, схожого за структурою з ТХДД. Під час відсутності індуктора Ah-рецептор зв'язан з білком теплового шоку hsp90, що являє собою компонент системи шейперонів, що регулюють стероїд - і діоксин-залежні шляхи передачі сигналу. У цьому випадку взаємодії білок-білок здійснюються через PAS-домен Ah-рецептора. Точна роль hsp90 в індукції CYP1А1 не визначена, хоча думають, що він підтримує конфігурацію Ah-рецептора в стані, що сприяє взаємодії з лігандом. У цитоплазмі Ah-рецептор і hsp90 також взаємодіють з білком 37-38кд, гомологічним FK506-єднальним білкам, що мають три тетратрикопептидних повтори. Посилення експресії цього білка супроводжується майже 2-х кратним посиленням індукції CYP1А1. Роль цього білка в індукції CYP1А1 також неясна. Можливо, він може впливати на взаємодію Ah-рецептора з лігандом і/чи сприяти його транслокації в ядро. Ah-рецептор відноситься до сімейства факторів транскрипції, названих “helix-loop-helix/PAS”, тобто спіраль-петля-спіраль, що містять PAS домен, завдяки якому здійснюється взаємодія з іншим білковим фактором ARNT (Ah Receptor Nuclear Translocator), що необхідно для активації транскрипції гена CYP1А. У результаті гетеродимеризації цих білків, що відбувається в ядрі, утвориться ДНК єднальний фактор транскрипції. ARNT експрессируется в багатьох тканинах. Нокаутні по цьому білку миші гинули на 10-ий день розвитку, що, можливо, відбиває участь ARNT як фактора транскрипції в сигнальній трансдукції.Гетеродимеризації ARNT і Ah-рецептора здійснюється через HLH і PAS домени, у результаті чого позитивно заряджені області білків можуть розпізнати XRE елементи ДНК. Дослідження Днк-білкових взаємодій показало, що ARNT зв'язується з 5' GTG 3' областю ХRЕ, а Ah – із сусіднім нуклеотидом. Промотор містив трохи сайтов зв'язування для базальних факторів транскрипції, включаючи ТАТА-зв'язуючі білки (ТВР). Аналіз мутацій в області промотору показав, що Що ТВР- зв'язуючі сайти також необхідні для транскрипції гена CYP1А1. Коли енхансери неактивні, промотор не функціонує, отже, взаємодія білків із проксимальними елементами гена є индуцибельним і залежить від активації Ah-рецептора і ARNT білка. Ці результати представляються цікавими, тому що з них випливає кілька важливих висновків: 1. Промотор знаходиться під контролем енхансера; 2. Повинний існувати механізм, що підтримує промотор у неактивному стані; 3. Взаємодія енхансера з промотором є необхідним етапом в активації транскрипції гена CYP1А1. Таким чином, Ah-рецептор і ARNT білок підсилюють транскрипцію гена CYP1А1. Показано також, що з XRE можуть взаємодіяти також молекули, що не відносяться до рецепторів. До дійсного часу сформувалося представлення про те, що події, що випливають після зв'язування комплексу с-Srс-аh-рецептор з лігандом, можуть протікати в двох незалежних напрямках: 1. Цей комплекс може транслоцироваться в ядро, як це вже було описано вище, і зв'язуватися зі специфічними XRE (DRE)-елементами; 2. Активація Ah-рецептора підсилює активність тирозинкіназ, у результаті чого зростає транспорт глюкози, підсилюються процеси фосфорилирования, а також активність липопротеинлипази. Цей, так називаний DRE-незалежний шлях відіграє істотну роль у розвитку токсических процесів, викликаних диоксинами й іншими ПАУ-з'єднаннями.Існує також негативна регуляція, у тому числі в різних тканинах і видах тварин. Було показано, що деякі ДНК-єднальні білки можуть конкурувати за зв'язування з цис-активними елементами. Виявлені також цис-активні негативні елементи, що ингибируют конститутивну і індуцируєму транскрипцію гена CYP1А1. Молекулярні механізми цього явища залишаються нез'ясованими.Крім того, що Ah-рецептор регулює експресію генів CYP1А, він також визначає токсичність багатьох ПАУ-соединений. Дослідження з вивчення залежності структура-активність з використанням інбредних ліній мишей, що розрізняються по чутливості до індукції цими з'єднаннями, показали, що багато хто з галогенованих поліциклічних вуглеводнів, зв'язуючись з Ah-рецептором, індуцирують не тільки CYP1А, але і виявляють високу токсичність. Ці дані, доповнені експериментами з Ah-нокаутними мишами, що виявилися стійкими до токсичної дії ТХДД, підтвердили гіпотезу, що ксенобіотики, подібні ТХДД, реалізують біохімічні і токсичні ефекти через Ah-рецептор. Наявність цього білка, зміст якого широко варіює для багатьох видів тварин і в багатьох тканинах, а також його здатність зв'язуватися з лігандами й активувати експресію багатьох генів, дало можливість припустити, що токсична дія ПАУ здійснюється через зміну експресії генів у чуттєвих клітках.
При індукції Пау-соединениями в печінці експериментальний тварин поряд з CYP1А1 реєструється інший білок цієї підродини – цитохром Р450 1А2. CYP1А2, на відміну від CYP1А1, конститутивно експресується в печінці експериментальних тварин і людини і, отже, метаболізуєт багато хімічних сполук без індукції. Субстратами для CYP1А2 є гетероциклічні аміни, ариламіни і нітрозоаміни. Останнім часом з'явилися докази участі цього ферменту в метаболізмі ендогенних з'єднань, у тому числі стероїдів.Під дією таких індукторів, як ТХДД, МХ чи бензантрацен відбувається індукція CYP1А2, що супроводжувалося помітним збільшенням рівня мРНК, кількості білка, визначеного імуноферментним аналізом, а також посиленням фенацетин-о-діетилазної активності. Показано роль Ah-рецептора і ARNT білка в активації транскрипції гена CYP1А2.СYР1А2, як і CYP1A1 може бути активований через Ah-рецептор. У 5'-фланкуючій області даного гена знайдені елементи, з якими зв'язується Ah-рецептор у комплексі з Arnt. Для цього гена також були ідентифіковані негативні і позитивні елементи. В експериментах з мишами, нокаутними по Ah-рецепторі (генотип Ah-/-) показане зниження конститутивного рівня мРНК СYР1А2 на 80% . Механізм конститутивної експресії залишається невідомим. Можливо, існує ендогенний ліганд, взаємодіючий з даним рецептором, оскільки в експериментах in vitro показано, що під час відсутності ліганда Ah-рецептор не здатний зв'язуватися з ДНК. З іншого боку, маються дані про те, що ксенобіотики, що не є високоафінними лігандами, чи взагалі що не є лігандами, наприклад омепразол, можуть змінювати експресію гена СYР1А2. Можливо, у подібних випадках Ah-рецептор активується без прямого зв'язування, приблизно генеруючи метаболіти з дуже коротким часом життя.В даний час накопичуються докази загального сигнального шляху запуску транскрипції генів CYP1А різними з'єднаннями. Механізм активації конститутивної експресії цього гена через Ah-рецептор залишається невідомим. Одним з можливих пояснень може бути існування ендогенного ліганда, що взаємодіє з даним рецептором. З іншого боку, з'являється усе більше повідомлень про те, що індукція CYP1А2 може здійснюватися не тільки через Ah-рецептор. Точний механізм цього явища залишається на сьогоднішній день невідомим. Передбачається, що в таких випадках активізуються посттранскрипционние механізми стабілізації мРНК чи пострансляционная стабілізація білка через утворення комплексу фермент-індуктор.
Цитохроми Р450 2В підродини катализируют метаболізм багатьох лікарських препаратів і інших ксенобіотиків з найрізноманітнішою хімічною структурою. Ідентифіковано такі гени цієї підродини, як: СYР2В1, СYР2В2, СYР2В3, СYР2В8, СYР2В14, СYР2В14Р; у кроликів: СYР2В4, СYР2В4Р, СYР2В5; у мишей: СYР2b-9, СYР2b-10, СYР2b-13, у людини: СYР2В6 і псевдоген СYР2В7Р.У метаболізмі ксенобіотиків беруть участь головним чином СYР 2В1 і 2В2 білки.Каталітичні властивості цих ферментів і регуляція експресії генів істотно розрізняються. CYP2В1 активно метаболизирует широкий спектр липофильних ліків і стероїдів. CYP2В2 можуть метаболизировать ті ж субстрати, що і CYP2В1, однак, швидкість метаболізму помітно нижче. Обидва білки складаються з N-термінальних гідрофобних ділянок порядку 20 амінокислот, що служить для закріплення в мембрані; цис/гем сполучного пептиду; субстрат-сполучного ділянки і району, що взаємодіє з НАДФ-Н-цитохром Р450 редуктазой.Фенобарбітал є прототипом великої групи структурно неспоріднених індукторів (органічні розчинники, пестициди, хлоровані бифенили і ліки), що впливають на багато клітинних процесів і викликають посилення експресії різних генів. Механізм індуцирующої дії ФБ широко дискутується і поки до кінця не ясний. Крім цього, невідомо, чи є дія індукторів ФБ-типу універсальної, як це описано для поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ), що мають планарну будову. ФБ-подобними індукторами є ізосафрол, транс-стильбен оксид, алілізопропілацетамід, хлордан і інші хлорорганічні пестициди, різні фенотіазіни, неплоскі галогеновані біфеніли, і канцерогени, такі як ацетиламінофлуорен. При порівнянні ФБ із близькими барбітуратами рівень індукції тісно корелює з періодом напіврозпаду барбитурата в плазмі; речовини з низьким рівнем метаболізму і відповідно великим часом напіврозпаду є більш могутніми індуцирующими агентами. У випадку ФБ, саме вихідна речовина, а не його основний метаболіт, р-гідроксифенобарбітал, очевидно, є індуктором. Фенобарбіталом индуцируются наступні підродини цитохромів: CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2H, CYP3A, CYP6A, CYP102/106. Індукція цитохрома Р450 барбитуратами прямо зв'язана з періодом напівжиття ліків в плазмі крові. ФБ індуцирує не тільки цитохроми Р450, але й інші ферменти, що беруть участь у метаболізмі ксенобіотиків: альдегид-дегідрогеназу, епоксидгідролазу, НАДФ-Н-цитохром Р450 редуктазу, УДФ-глюкуронілтрансферазу і деякі глютатіон S-трансферази. При цьому підсилюється також проліферація гладкого ЕПР, збільшується вага печінки. Крім того, ФБ є промотором раку. Усе перераховане вище говорить про плейотропну дію цих ліків на багато ферментативних систем клітки, але індуцируються найбільше ефективно цитохроми Р450 підродини 2В. На противагу генам CYP1А, у механізм індукції генів CYP2В вовлечени так називані орфанові рецептори, фізіологічні ліганди для яких залишаються невідомими. Ці білки належать до сімейства ядерних стероїдних рецепторів. Недавно був ідентифікований новий орфановий рецептор СА, що бере участь в активації генів CYP2В. Показано, що цей рецептор зв'язується з PBRE цис-активними елементами гена CYP2В2 лише у виді гетеродимера з ретиноидним рецептором RXR. Передбачається, що активація ДНК-єднальної здатності CAR білка може відбуватися за рахунок фенобарбітала, що може стимулювати транслокацию рецептора в ядро і його зв'язування з PBRE-елементами. Загальноприйнята на сьогоднішній день схема індукції фенобарбіталом, разработанна американським ученим Негіши. Можливо також існування іншого механізму, відповідно до якого CAR білок може знаходитися в ядрі, а ФБ лише підсилює його ДНК-єднальну здатність. Приклади для обох типів регуляції показані для інших ядерних рецепторів Знайдено регуляторні ділянки генів - ФБ-відповідальні елементи (PBRs), з якими взаємодіють фактори транскрипції. Основний принцип цього механізму полягає в тому, що при ФБ-индукції відбувається дерепресія гена CYP через звільнення белка-репресора. Цей білок тримає в зв'язаному стані ділянку ДНК розміром 17 п.о., названий Барбі-бокс (Barbie box). Цікавий той факт, що подібна область з характерним мотивом АААГ була знайдена в генах ФБ-індуцируємих цитохромів Р450 ссавців: CYP 2В1, 2В2, 3А2, 2С1
Досить часте посилення метаболізму ксенобіотиків приводить до зниження їхньої токсичності.