Підготовку матеріалу до гістологічних досліджень проводили в стандартних умовах. Нирку з трансплантатом або фрагменти культури фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зневоджували етанолом і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5-7 мкм виготовляли так, щоб гістологічна поверхня включала трансплантат і оточуючі тканини – паренхіму і капсулу нирки. Зразки забарвлювали гематоксиліном та еозином. Препарати досліджували під світлооптичним мікроскопом при збільшеннях об’єктиву х20, х40 і х60. Мікрофотографії отримували за допомогою мікроскопу Olimpus з цифровою камерою і пакетом прикладних програм для обробки зображення.
Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) - для непараметричних даних.
Морфофункціональні властивості органотипових культур щитоподібних залоз в умовах специфічної і неспецифічної стимуляції та комбінованого культивування. Одним із якісних параметрів оцінки функціонального стану культури є її здатністьвідповідати на стимуляцію змінами гормональної активності. Функціональним параметром життєздатної культури прийнято вважати її здатність виключати із клітин суправітальні барвники (розчин трипанового синього тощо). Дані, представлені в табл. 1 свідчать, що показник життєздатності клітин ОКЩЗ НП після комбінованого культивування з ОКНЗ був на 19,53% вищий за такий клітин монокультур ОКЩЗ НП.
Таблиця 1
Вплив комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин на життєздатність клітин ОКЩЗ щурів і новонароджених поросят (М±m, n=7)
| Експериментальні групи дослідних зразків | Життєздатність, %1 | |
| Ендокринні залози щурів | Ендокринні залози НП | |
| ОКЩЗ (4 доба культивування) | 43,28±1,27 | 52,68±0,72 |
| Комбіновані культури ЩЗ із НЗ | 62,81±0,61 | 68,25±0,021 |
| Комбіновані культури ЩЗ із гіпофізом | 56,92±0,084 | 64,36±0,016 |
Примітка.1 за 100%-в прийнято кількість життєздатних клітин інтактних ЩЗ.
Аналогічна тенденція зберігалась і в комбінованих з НЗ ОКЩЗ щурів. Зафіксовано відносне збільшення життєздатних клітин в ОКЩЗ після комбінованого культивування з експлантатами гіпофізу (табл.1).
Вивчення гормональної активності ОКЩЗ щурів після культивування в присутності специфічних і неспецифічних стимуляторів гормонопоезу показало, що на 4 добу інкубації рівень базальної секреції Т4 ОКЩЗ в середовище культивування складав 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Це значення було прийнято за контрольне по відношенню до всіх експериментальних зразків, отриманих із ЩЗ щурів.
Із представлених на рис. 1 (А) даних видно, що сумісна інкубація ОКЩЗ з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня секреції тироксину в середовище інкубації.
Активація Т4-гормонопоезу спостерігалась і у випадку застосування дб-цАМФ. Крім того, виявлено, що біологічно активні речовини НЗ стимулювали секрецію Т4 при комбінованому культивуванні ОКЩЗ із ОКНЗ. Рівень тироксину в середовищі за таких умов культивування складав 124,02±12,4 нмоль/г білка (n=6, р<0,05) в порівнянні з контрольним значенням - 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Однак, при інкубації тканин ЩЗ і НЗ в присутності дб-цАМФ отримано ефект відміни дії стимулятора (рис.1 (А)).
При спробі відокремити дію глюкокортикоїдів від загального впливу ОКНЗ встановлено, що залежність концентрації тироксину в середовищі культивування від концентрації кортикостерону мала лінійний характер (рис. 1 (Б)). Додавання 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулюючим ефектом не супроводжувалось, а при збільшенні його концентрації до 0,5-1,0 мкг/мл зростав і рівень Т4. Слід зазначити, що концентрація кортикостерону в плазмі периферійної крові щурів значно нижча, ніж в плазмі венозної надниркової крові (Резников А.Г., 1980), тому, для більш коректної інтерпретації даного ефекту, за фізіологічне значення слід приймати концентрацію 0,5 мкг/мл.
Отримані дані свідчать про здатність ОКЩЗ щурів реагувати на дію стимуляторів шляхом ТТГ-рецепторної і неспецифічної внутрішньоклітинної відповіді. Процеси, що відбуваються в ОКЩЗ на клітинному рівні під дією дб-цАМФ полягають у здатності цАМФ і його аналогів запускати аденілатциклазний каскад і, тим самим, індукувати синтез і секрецію тиреоїдних гормонів (Steinfelder H.J. et al., 1991; Steinfelder H.J. et al., 1992; Weintraub B.D. et al., 1989). Оскільки кортикостерон також стимулював секрецію Т4 (в залежності від концентрації), припустимо, що з усього спектру біологічно активних речовин НЗ саме глюкокортикоїди стимулювали секрецію тироксину ОКЩЗ щурів в умовах сумісного культивування з ОКНЗ.
При культивуванні ОКЩЗ новонароджених поросят виявлено, що на 4 добу інкубації базальний рівень секреції Т4 в середовище культивування складав 36,29±1,79 нмоль/г білка (n=8, р<0,05) (рис. 2), дане значення було прийняте за контрольне по відношенню до зразків, отриманих із ендокринних залоз новонароджених поросят.
Представлена концентрація Т4 у середовищі культивування після інкубації ОКЩЗ НП в присутності модифікаторів гормонопоезу, звідки бачимо, що 2-годинна інкубація з концентрацією ТРГ 200 мкг/мл не супроводжувалась істотним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з 12-годинною інкубацією в присутності 4,4 нг/мл ТРГ. Рівень тироксину в останньому випадку вірогідно зростав більш ніж в два рази порівняно з контрольними параметрами і складав 104,55± 4,67 нмоль/г білка (n=7, р<0,05). Інкубація ОКЩЗ НП протягом 2 годин в присутності ТРГ (200 мкг/мл) і експлантатів гіпофізу також не стимулювала секрецію тироксину, а 12-годинна інкубація зазначених тканин з 4,4 нг/мл ТРГ сприяла деякому зниженню рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з його базальними значеннями, що може бути пов’язано з впливом ТРГ на гіперпродукцію ТТГ і супресію секреції Т4. 24-годинна інкубація ОКЩЗ НП з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування. Дані ефекти підтверджують припущення щодо підтримання сигнальних регуляторних взаємовідносин в системі гіпоталамус-гіпофіз-ЩЗ, змодельованій in vitro.
Комбіноване культивування ОКЩЗ НП з ОКНЗ НП вірогідно збільшувало рівень Т4 в середовищі культивування (рис. 2 (А)). Додавання в інкубаційне середовище дб-цАМФ також стимулювало Т4-гормонопоез, але при дії дб-цАМФ на комбіновані культури (ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП) рівень секреції Т4 був нижчий в порівнянні з окремою дією стимулятора та вищий за контрольне значення. При інкубації ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП і ТТГ (10 мкМО/мл) зафіксовано аналогічний ефект відміни стимулюючої дії модифікатора (рівень Т4 в середовищі інкубації не відрізнявся від контрольних значень).
Отримані результати дозволяють стверджувати, що комбіноване культивування в присутності стимуляторів не приводить до вірогідного збільшення рівня тироксину в середовищі культивування на відміну від вираженого стимулюючого впливу кожного модифікатора окремо.
Як видно з даних, представлених на рис. 2 (Б), кортикостерон вірогідно збільшував рівень секреції тироксину в середовище культивування ОКЩЗ НП по відношенню до контролю. При цьому фізіологічні концентрації зумовлювали максимальний стимуляторний ефект. Так, внесення 0,5 мкг/мл кортикостерону (фізіологічна норма плазми венозної надниркової крові щурів) сприяло вірогідному підвищенню рівня тироксину в середовищі культивування ОКЩЗ як щурів (рис. 1 (Б)), так і новонароджених поросят (рис. 2 (Б)), тоді як додавання в інкубаційне середовище 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулювало секрецію Т4 тільки культурами ЩЗ новонароджених поросят.
Корекція експериментального гіпотиреозу і супутніх порушень метаболізму шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур щитоподібних і надниркових залоз. Комбінована трансплантація двох видів ендокринних тканин/клітин може бути як одним із способів імунопротекції основного графту (De Fazio S.R. et al., 1994), покращення його трофіки (Agrawal A.K. et al., 2004; Emerich D.F. et al., 2003), так і способом локального впливу на регуляторно-трофічні процеси в самому трансплантаті (Kukreja S.C. et al., 1979).
З метою оцінки ефекту комбінованої трансплантації тканин ЩЗ і НЗ на вміст тироксину і тиротропіну в плазмі крові гіпотироїдних щурів, а також на деякі показники метаболічних процесів і ступінь їх компенсації проводилась трансплантація монографтів і комбінованих ауто-, ало- и ксенографтів НФ і органотипових культур ЩЗ та культур ЩЗ і НЗ з попереднім сумісним культивуванням щурам з післяопераційним гіпотиреозом. Отримані показники порівнювали з відповідними в групах тиреоїдектомованих та інтактних тварин. На 30 добу після трансплантацій в плазмі крові експериментальних тварин вимірювали вміст Т4, ТТГ і деяких біохімічних показників – альбуміну, глюкози з вуглеводним навантаженням і холестерину та проводили гістологічні дослідження екстирпованих трансплантатів.
Вміст тироксину в плазмі крові контрольних тварин дорівнював 61,71±1,1 нмоль/л (n=7, р<0,05), у тиреоїдектомованих – 18,26±0,8 нмоль/л (n=7, р<0,05) (рис. 3), що свідчить про адекватність моделі післяопераційного гіпотиреозу.
Трансплантати НФ ЩЗ алогенного походження виявились більш ефективними в корекції гіпотиреоїдного стану (рис. 3 (А)), що зумовлювалось менш вираженими процесами відторгнення трансплантату завдяки видовій специфічності тканин донора і реципієнта.
Трансплантація нативних ксенографтів ЩЗ новонароджених поросят сумісно з фрагментами НЗ на 56,6% сприяла збільшенню рівня Т4 в порівнянні з тиреоїдектомованими тваринами (рис. 3 (Б)), а нативних фрагментів ЩЗ без НЗ – на 34,3% (рис. 3 (А)).
Після комбінованої алотрансплантації сумісно культивованих ОКЩЗ із ОКНЗ спостерігалося зростання рівня Т4 на 35,0% в порівнянні з тиреоїдектомованими тваринами і на 14,6% в порівнянні з комбінованою трансплантацією окремо культивованих відповідних тканин (рис. 3 (Б)). Комбіноване культивування також зумовило підвищення рівня тироксину в плазмі крові тварин-реципієнтів після сумісної ксенотрансплантації ОКЩЗ із ОКНЗ в порівнянні з ксенотрансплантацією окремо культивованих відповідних тканин.