Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов (стр. 3 из 5)
1.5.3 Анализ структурных вирусных полипептидов
В большинстве случаев проводится электрофорез в пластинах полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Na, как было описано впервые Даймэком и Ватсоном. Модификация данного метода изложена в работе. Гели окрашивают кумасси бриллиантовым синим, а для авторадиографического анализа экспонируют с рентгеновской пленкой. На рис. 6 представлены спектры структурных полипептидов ВПГ-1 и ВПГ-2, полученные гель-электрофорезом. Другие характеристики этих полипептидов приведены в табл. 1.
Таблица 1. Свойства и номенклатура некоторых белков ВПГ-1 и ВПГ-2
| ВПГ-2 | Свойства | ВПГ-1 | ||||
| номер белка | структурный вирусный белок | молекулярная масса | молекулярная масса | структурный вирусный белок | номер белка | |
| ICSP 5–8 ICSP 9ICSP 10ICSP 11ICSP 12ICSP13–15ICSP 22 NNISP34–35NN NNICSP 46–47 | NS VP5 NS NSVP7–8,5NSNNNSNS NNVP22–23 | 182–186157153146143 126–14085–90925442 4 5328–30 | Предранний фос-фопротеинОсновной белок капсидаРибонуклеотидре-дуктазаОсновной ДНК-связывающий белокГликопротеины gA, gBЩелочная нуклеа-заГликопротеин gEБелок, ассоциированный с ДНК-полимеразойТимидинкиназаГликопротеин gD, ответственный за перекрестную нейтрализацию между ВПГ-2 иВПГ-1Белок капсида | 175 155149 132 112–12685–90804844 5930–33 | NS VP5 NS NSVP7–8,5NSNNNSNS VP18VP22–23 | ICP 4 ICP 5 ICP 6 ICP 8ICP 9–14ICP 19NNICP 29NNICP 31ICPJ39–40 |
1.6 Другие а-герпесвирусы
В нашей лаборатории выращены и очищены и многие другие а-герпесвирусы, включая: вирус мамиллита крупного рогатого скота; вирус псевдобешенства; вирус герпеса лошадей типа 1; вирус ринотрахеита кошек; вирус кошачьего сомика. С этими вирусами работают практически так же, как и с вирусами простого герпеса. Поэтому ниже мы отметим только особенности работы с каждым из перечисленных выше вирусов.
1.6.1 Вирус мамиллита крупного рогатого скота и вирус псевдобешенства
Эти вирусы дают на клетках ВНК высокие титры, которые легко определить суспензионным методом, предложенным Расселом. Для очистки вирусов клетки ВНК заражают с высокой множественностью инфекции и культивируют при 37°С 24 ч или 48 ч. На этой стадии вирусы могут быть очищены. Таким образом, получают качественные препараты оболочечных вирусов, белковый спектр которых представлен на рис. 7.
1.6.2 Вирус герпеса лошадей типа 1
Рестрикционный анализ показывает, что разные штаммы EHV-1 могут принадлежать как субтипу 1, так и субтипу 2. Первый связан с выкидышами у кобыл, хотя выделяют его и из респираторного тракта. Второй относится к вирусам "респираторного типа" и не связан с выкидышами. Вирусы субтипа 1 размножаются во многих культурах. В нашей лаборатории мы обычно используем клетки линии RK13, хотя в других лабораториях предпочитают использовать клетки лошадей. Кроме того, вирусы субтипа 1 успешно размножаются в культурах клеток L-M. Некоторые штаммы субтипа 1 были адаптированы к росту на хомяках. Вирусные изоляты субтипа 2 растут только в клетках лошадей. Используя метод 1, можно проводить очистку вирусов обоих субтипов. На рис. 7 показаны спектры полипептидов EHV-1, BMV, PRV, ВПГ-1 и ВПГ-2.
1.6.3 Вирус ринотрахеита кошек
Этот вирус специфичен для клеток кошачьего происхождения. Культивируют его так же, как и ВПГ-1. Для наращивания вируса мы используем, как правило, линию клеток кошки, представленную д-ром П. Тэлботом, однако можно использовать эмбриональные клетки легкого кошки, полученные доктором О. Джэр-ретом и поставляемые фирмой FlowLaboratories, Irvine, Scotland. Доктор P. Мэйес в градиенте тартрата калия успешно выделил вирус из культуральной среды инфицированных клеток почки кошек Crandell-Rees.
1.6.4 Вирус кошачьего сомика
Данный вирус имеет ограниченный круг хозяев и лучше всего размножается в клетках американского сомика-кошки. Методы культивирования и очистки этого вируса такие же, как и для ВПГ-1, за исключением того, что ВВ-клетки и вирус культивируют при 28°С.
2. Цитомегаловирус человека
Р-субгруппа герпесвирусов включает в себя цитомегаловирусы различных животных. Цитомегаловирусы человека вызывают различные заболевания, особенно у людей с ослабленной иммунной системой, а также в период беременности. Инфекция этими вирусами довольно часто приводит к смертельному исходу либо вызывает сильнейшее истощение больных с естественной или искусственной иммунной супрессией. Во время беременности этот вирус может вызвать уродства плода, выкидыши и повышенную чувствительность новорожденных к тяжелым инфекциям после родов. Именно по этим причинам в последние 10 лет резко возросла интенсивность изучения цитомегаловируса. Тем не менее, в этой области в отличие от вирусов простого герпеса не достигнуто значительного прогресса.
2.1 Получение заготовок вируса
Репликативный цикл цитомегаловируса человека продолжительнее, чем штаммов ВПГ. Кроме того, данный вирус прочно ассоциирован с клеткой и имеет высокую клеточную специфичность. Хотя во многих лабораториях для наращивания этого вируса используют клетки MRC-5, Flow 5000 или Нер-2, В. Гибсон рекомендует ранние пассажи на фибробластах крайней плоти человека или клетках легкого эмбриона человека. Гибсон культивирует перечисленные клетки в среде DMEM, содержащей 4500 мг/л глюкозы и 10% ЭТС. В нашей лаборатории используют клетки MRC-5, культивируемые в среде Игла в модификации Glasgow с 10% ЭТС. Заготовки вируса получают следующим образом:
1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, добавляют CMV в минимальном объеме среды. Адсорбцию вируса проводят 1–2 ч при 37°С.
2. После адсорбции к клеткам добавляют необходимый объем культуральной среды и инкубируют их при 37°С.
3. Через 7–10 дней после заражения старую культуральную среду заменяют на свежую. Клетки продолжают инкубировать при 37°С до выявления признаков ЦПД.
4. Культуры ежедневно просматривают. Когда ЦПД достигнет своего максимума, клетки собирают в культуральную среду и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Собирают супернатант.
5. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С.
6. Большая часть вируса содержится в культуральной среде, поэтому супернатант, полученный на стадии 4, центрифугируют 2 ч при 12000 об/мин в роторе GSA.
7. Полученный осадок ресуспендируют в небольшом объеме культуральной среды, осторожно разрушают в ультразвуковой бане и хранят при –70°С. Данный вирус не так стабилен при –70°С, как ВПГ. Поэтому его не следует подвергать частым замораживаниям и оттаиваниям. Оттаивание CMV, как и ВПГ, следует проводить быстро в теплой воде.
2.2 Цикл размножения
Смит и Де Харвен сравнили кривые роста ВПГ и CMV и определили время наступления тех или иных фаз инфекции. Результаты этих исследований приведены на рис. 8 и в табл. 2. Однако остается непонятным, насколько точно отражают данные кривые последовательность событий в зараженной клетке. Как уже отмечалось выше, цикл размножения CMV значительно длиннее, чем ВПГ.
Таблица 2. Время наступления основных этапов инфекции CMV и ВПГ. Сравнительные данные, полученные при помощи электронной микроскопии
| Этапы | Начало события | |
| CMV | ВПГ | |
| Слияние клеток и округление | 0,5 | 6 |
| Изменения аппарата Гольджи | 1 | 8 |
| Скрытый период | 2 | 2 |
| Появление большого количества гранул, напоминающих перихроматин | 2 | 3 |
| Конденсация хроматина | Не наблюдается | 3 |
| Сборка в ядрах первых капсидов | 3 | 4 |
| Появление первых капсидов, имею- | 3,5 | 5 |
| щих плотную сердцевину | ||
| "Одевание" ядерной мембраной | 3,5 | 6 |
| Появление "голых" капсидов в цито- | 4 | 6 |
| плазме | ||
| Появление плотных цитоплазматиче-ских агрегатов | 4 | Не наблюдается |
| Первые высвободившиеся из клетки частицы | 4 | 8 |
| Удвоение ядерной мембраны | 4 | 8 |
| "Одевание" цитоплазматической мембраной | 4 | 8 |
| Лизис клетки | 7–8 | 24–48 |
2.3 Идентификация вируса
Множество попыток было предпринято для разработки удобных методов титрования медленно растущих вирусов. В большинстве лабораторий остановились на методе определения конечной точки TCID50. Сложность данной проблемы заключается в сохранении клеточного монослоя в течение времени, необходимого для формирования бляшек. В нашей лаборатории используют следующую модификацию метода бляшек, рекомендованную Вентвесом и Френчем:
1. Клетки линии MRC-5 высевают в 24-луночные планшеты или в чашки Петри диаметром 30 мм для культивирования клеток. Культуры, достигшие состояния монослоя, инфицируют вирусом, разведенным в 200 мкл культуральной среды.
2. По истечении первого часа адсорбции среду заменяют на 1%-ную агарозу, приготовленную на культуральной среде с 2% ЭТС. Клетки инкубируют при 37°С.
3. Через неделю еще раз добавляют необходимое количество агарозы и продолжают инкубацию при 37°С.
4. Через 2–3 нед с момента заражения под микроскопом удается обнаружить небольшие очаги инфицированных клеток. Незадолго до того, как разрушится монослой неинфицированных клеток, культуры фиксируют в забуференном формалине, осторожно удаляют агарозу и окрашивают 1%-ным генцианвиолетом. Небольшие очаги инфекции можно подсчитать под стереомикроскопом. Вместо генцианвиолета культуры можно окрашивать 1%-ным нейтральным красным. Кроме того, нам удалось получить бляшки CMV, используя КМЦ вместо агарозы.
2.4 Метод черных бляшек