Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов (стр. 5 из 5)

3.3 Цикл размножения

Обычно для получения кривых роста в культуры вносят вирус с высокой множественностью инфекции, а затем через короткие промежутки времени собирают вирус. Таким образом, получают кривую роста HVS. Однако интерпретировать полученные результаты следует с осторожностью. Рэн-делл и Хонес показали, что в этих условиях во многих клетках задерживается инициация вирусной репликации. Если это действительно так, то цикл размножения HVS в одной инфицированной клетке может завершиться за 18 ч.

Возможно, что репликация вируса зависит и от клеточного цикла. Эти сложные исследования велись с помощью иммунофлуоресценции на основе моноклинальных антител к антигенам зараженных клеток.

3.4 Получение очищенного вируса

1. Монослойные культуры, выращиваемые в роллерных флаконах, инфицируют с низкой множественностью инфекции, как описано выше. Через 4–5 дней вирус осаждают из культуральной среды центрифугированием при 25000 об/мин 30 мин в роторе SW27. При необходимости через 2 дня после заражения вносят радиоактивную метку.

2. Осадок ресуспендируют в соответствующем буфере. Полученную суспензию по возможности следует оставить на ночь при 4°С.

3. Суспендированный осадок наслаивают на градиент глицерина или сахарозы и центрифугируют при 19000 об/мин 20–30 мин в роторе SW27. После центрифугирования при просмотре пробирок в рассеянном свете обнаруживается одна полоса в центре градиента.

4. Фракцию, состоящую более чем на 90% из вирусных частиц, имеющих оболочку, отбирают, центрифугируют 1 ч при 25000 об/мин и ресуспендируют в соответствующем буфере.

В результате первого градиентного центрифугирования получают осадок, содержащий большое количество вируса. Осадок можно ресуспендировать и дополнительно очистить вторым градиентным центрифугированием. Фракции очищенного вируса могут быть использованы для определения концентрации белка, количества физических частиц и инфекционного титра. Для исследования вирусных частиц электрофорезом в полиакриламидном геле вирус разрушают, как описано выше для ВПГ. Спектр структурных полипептидов HVS штамма 11 показан на рис. 16.