Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов (стр. 1 из 5)

Курсовая работа

на тему:

"Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов"

Введение

В группу герпесвирусов входят, вероятно, более 70 вирусов, имеющих широкий круг хозяев. Характеристика и классификация вирусов этой труппы детально рассмотрены Мэтьюсом. Герпесвирусы подразделяют на три подсемейства: α-герпесвирусы; β-герпесвирусы; γ-герпесвирусы. Разделение на подсемейства основано на нескольких критериях, в частности на характере репликации вирусов, круге хозяев, белковом составе и структуре генома.

В этой работе мы обсудим культивирование, очистку и титрование герпесвирусов, взяв в качестве примера по одному представителю каждого из подсемейств, указанных выше. Особое внимание, однако, будет уделено вирусам простого герпеса – наиболее интенсивно изучаемым вирусам этой группы. Будут рассмотрены цитометаловирус человека и герпесвирус саймири.

1. Вирусы простого герпеса типов 1 и 2

Эти два вируса входят в а-подгруппу герпесвирусов. Они вызывают разнообразные заболевания человека, такие, как воспаление десен, стоматит, менингит, энцефалит и венерическую форму воспаления гениталий. Эти вирусы вызывают заболевания в ослабленных организмах. Некоторые факты указывают на связь вируса простого герпеса типа 2 с раком шейки матки, а вируса простого герпеса типа 1 с некоторыми другими злокачественными новообразованиями. Именно поэтому данным герпесвирусам, в особенности последние 10 лет, уделяют пристальное внимание. За последнее время были разработаны высокоэффективные методы наращивания, очистки и титрования этих вирусов. Методы изучения ВПГ-1 – и ВПГ-2 сходны между собой.

1.1 Получение заготовок вируса

1.1.1 Клетки

Широкий круг хозяев ВПГ-1 и ВПГ-2 позволяет получать заготовки вирусов на различных клетках. Тем не менее, выбор чувствительной культуры не прост из-за того, что выход вирусов в различных клеточных линиях широко варьирует. На практике для получения заготовок вируса часто используют клетки линии Нер-2 или ВПК с КЗ. Работы, проведенные с ВПГ-1 и ВПГ-2 в нашей лаборатории, показывают, что выход различных штаммов отличается примерно в 10 раз для данных клеточных линий. Хотя из этих двух линий клетки ВНК менее требовательны к условиям культивирования, клетки обеих линий достигают высокой плотности в роллерных сосудах как из стекла Winchester, так и из пластика. В сосудах такого большого объема особенно важно поддерживать оптимальный рН. При использовании бикарбонатного буфера культуральную среду необходимо насыщать С0₂ еще до стерилизации. В противном случае клетки следует выращивать в атмосфере с высоким содержанием С0₂. Аппаратуру для одновременного культивирования большого количества роллерных сосудов можно купить или изготовить в мастерских. Например, на рис. l'O.l сфотографирован аппарат, изготовленный из рамы Dexion, колес Meccano и моторов Parvalux в тропическом исполнении.

Клетки указанных выше линий способны расти в различных питательных средах. Обычно мы используем автоклавируемую среду Игла в модификации Глазго с 10% ТС. Для клеток линии ВНК в среду следует добавить 10% триптозофосфатного бульона. Окончательный выбор клеточной линии зависит от ряда факторов, в частности от характера эксперимента. Естественно, что используемые для приготовления вирусных заготовок клеточные линии должны быть предварительно проверены на отсутствие микоплазмы.

1.1.2 Методы заражения

Основной метод заражения описан Ватсоном и др. Целесообразно перед началом работы получить первичную и вторичную заготовки вируса, которые по возможности следует разместить в нескольких холодильниках на –70°С. Как правило, рабочие заготовки получают из вторичных и таким образом исключают длительное пассирование вируса. При этом сводится к минимуму возможность получения вирусных заготовок, сильно отличающихся по номеру пассажа, что создает трудности в прямом сравнении данных, полученных в разных экспериментах. В большинстве случаев для получения вирусных заготовок мы используем роллерные культуры, почти достигшие монослоя. Во флаконах обычно содержится 5–10⁸ клеток ВНК или 3-10⁸ клеток Нер-2. Высокая концентрация клеток позволяет получить и высокий титр вирусной заготовки. Клеточный монослой промывают для удаления слабо прикрепленных клеток и затем из вторичной заготовки вносят разведенный вирус. Чаще всего мы предпочитаем заражать клетки при множественности инфекции 0,001–0,01 БОЕ/кл, что предотвращает накопление дефектных вирионов.

1.1.3 Наращивание вируса

Любая стандартная среда для культивирования клеток может быть использована для получения вирусных заготовок. Обычно для выращивания клеток мы используем среду с 10% ТС. Уменьшение концентрации сыворотки приводит к некоторому снижению выхода вируса, однако при этом экономится дорогостоящая сыворотка. Заготовки вируса получают, используя следующую методику:

1. Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, достаточном для покрытия монослоя. Множественность инфекции при этом составляет 0,001–0,01 БОЕ/кл.

2. Добавляют необходимое количество среды для культивирования клеток.

3. Клетки инкубируют 2–3 дня при соответствующей температуре. Однако продолжительное наращивание вируса при низкой температуре может привести к получению материала, содержащего большой процент температур-но-чувствительных мутантов или по крайней мере вируса, лучше растущего при 32°С, чем при 37°С. По этой причине мы предпочитаем инкубацию при 37°С.

4. Через 2 дня инкубации при 37°С начинают появляться признаки ЦПД, однако сроки их появления могут варьировать в зависимости от штамма вируса и линии клеток. Как правило, ВПГ-2 размножается заметно быстрее, чем ВПГ-1. Как известно, существует два вида ЦПД: синцитиальное и несинцитиальное. Морфологическая картина ЦПД, вызванного этими двумя штаммами, показана на рис. 2.

5. Клетки собирают после максимального проявления признаков ЦПД. Методика сбора клеток зависит от штамма вируса и линии клеток. Так, в случае штамма HFEM и клеток линии ВНК основную массу среды можно удалить из культурального сосуда без потери вируса. Затем клетки собирают в оставшуюся среду стерильной резиновой палочкой и центрифугируют при малой скорости. При работе с другими штаммами вируса, например штаммом 186, инфицированные клетки удается собрать только центрифугированием культуральной среды, поскольку большая часть клеток отрывается от поверхности сосуда. Если лизис клеток уже произошел, необходимо использовать среду как составную часть заготовки вируса. Клетки собирают центрифугированием, а затем ресуспендируют в выбранной среде, например стерильной дистиллированной воде или же обычной культуральной среде. Заготовки можно ресуспендировать в среде с криопротектором, хотя это и не является строго обязательным.

6. Одной из серьезных проблем, возникающих по мере получения заготовок вирусов герпеса, является их очистка от клеточного материала, поскольку большая часть вируса тесно связана с клетками. Клетки разрушают, проводя ряд циклов замораживания и оттаивания, однако это может привести и к снижению титра вируса. Обработка клеток ультразвуком небезопасна из-за возможного образования аэрозолей, содержащих инфекционный вирус. Поэтому лучше всего проводить дезинтеграцию в ультразвуковой бане в закрытом сосуде. К сожалению, мы не можем рекомендовать какую-либо определенную марку ультразвукового дезинтегратора. Необходимо проверять эффективность каждого из них. Вирусные заготовки обрабатывают ультразвуком до полного разрушения клеток. Процедуру проводят в ледяной воде, чтобы не допустить сильного нагревания.

7. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, готовые заготовки разливают в ампулы и хранят, как описано ниже. Заготовки вируса герпеса длительное время лучше всего хранить при –70°С. Ни при каких обстоятельствах не следует хранить вирусы герпеса при –20°С, поскольку это приводит к значительному снижению инфекционного титра. В течение нескольких дней штамм HFEM можно хранить при 4°С, однако этот срок варьирует для разных штаммов. Оттаивание вируса необходимо проводить быстро, по возможности следует избегать повторного замораживания и оттаивания. Тем не менее, мы показали, что штамм HFEM, имеющий высокий титр в культуральной среде, теряет всего лишь 0,51og инфекционного титра при пятикратном замораживании и оттаивании. Мы обнаружили, что и при быстром оттаивании вирусных заготовок, хранящихся при –70°С даже в течение 5 лет, не происходит снижения титра вируса. Перед использованием каждую заготовку необходимо проверить на стерильность как на твердой, так и в обогащенной жидкой бактериальных средах. Лучше всего проверять заготовки под электронным микроскопом, чтобы исключить использование тех заготовок, в которых велико соотношение физических и инфекционных частиц. Мы установили, что с помощью описанных выше методов удается получать заготовки с титрами около 10⁹–10¹⁰ БОЕ/мл и низкими соотношениями физических и инфекционных частиц.

1.2 Электронная микроскопия

Подсчет частиц по методу "1 оор drop" предложен Ватсоном. Вирус разводят в воде или в растворе, содержащем 0,2 мг ВСА/мл в случае вирусных препаратов с концентрацией белка ниже 0,2 мг/мл, В любом случае вирус разводят до концентрации 10⁹–10¹⁰ частиц/мл. Суспензию смешивают с равным объемом калибровочного материала. Мы рекомендуем использовать полистироловый латекс "DOW", содержащий -10⁹ латексных частиц/мл. К полученной смеси добавляют 0,12 мл нейтрального 2%-ного раствора фосфовольфрамата натрия. Одну каплю полученного материала наносят, а затем высушивают на формваровых сетках с ячейками размером: 400 меш. Сетки просматривают под электронным микроскопом при увеличении 40 000. Частицы, видимые под микроскопом, классифицируют как "голые", "покрытые оболочкой" и "покрытые оболочкой". Эти частицы представлены на рис. 5. Непроницаемые, покрытые оболочкой частицы выглядят как плотные белые шарики, однако можно показать их способность количественно превращаться в проницаемые, покрытые оболочкой частицы. Как правило, для характеристики каждого образца вируса просчитывают пять групп из 20 латексных частиц.