Генетически трансформированная ризогенная культура гармалы наряду с проявлением корневой дифференциации восстанавливала и способность к биогенезу индольных алкалоидов. Просмотр культур в УФ-свете показывал интенсивную флуоресценцию корней, типичную для гармина и гармалола. Хроматоспектрометрический анализ метанольных экстрактов из ризогенной культуры показал, что она по количественному и качественному составу алкалоидов мало отличается от корней ювенильных растений гармалы. Если при максимальном содержании b-карболиновых алкалоидов в неорганизованно растущих тканях концентрация гармина в них была более чем в 100 раз, а гармалола – в 5 раз ниже концентрации этих алкалоидов в корнях проростка, то в трёхнедельной ризогенной культуре 12-го пассажа концентрация гармина составляла 1/3 от концентрации алкалоида в корнях проростка, а концентрация гармалола превышала концентрацию алкалоида в корнях. При этом восстанавливалось и типичное для корней целого растения преобладание гармина над гармалолом.
| Содержание алкалоидов в ризогенной культуре гармалы (мг/г сухой массы корней) | ||
| Пассаж культуры | Гармин | Гармалол |
| 12-й пассаж (3-недельная культура) | 12,85 | 2,46 |
| 12-й пассаж (5-недельная культура) | 19,90 | 2,01 |
| Корни проростков | 50,66 | 2,16 |
| Стебель проростков | 10,85 | 1,84 |
Если принять во внимание интенсивность роста ризогенной культуры (20-кратное увеличение массы) и непрерывность её выращивания, то можно увидеть, что продуктивность такой культуры значительно превышает продуктивность ювенильных растений гармалы.
Таким образом, генетически трансформированная культура гармалы, наделённая способностью к синтезу гормонов, обеспечивающих появление корневой дифференциации, характеризуется высоким уровнем содержания b-карболиновых алкалоидов, который вполне сравним с уровнем биосинтеза этих алкалоидов в органах целого растения. Чётко установленная зависимость между корневой дифференциацией и уровнем синтеза b-карболиновых алкалоидов подтверждает правильность гипотезы о локализации образования этих индольных алкалоидов в корнях гармалы. В этом отношении ризогенная культура гармалы наряду с аналогичными культурами белладонны, дурмана, белены и других паслёновых служит примером корнеспецифичности биосинтеза определённых групп алкалоидов.
Результаты, полученные с трансформированной культурой гармалы, показывают возможность и эффективность использования приёмов генетической инженерии не только на растениях семейства паслёновых, но и на растениях других семейств, в которых образование алкалоидов или других вторичных веществ локализовано в корневой системе. Индукция биосинтеза вторичных веществ в таких генетически изменённых культурах может служить реальной основой для получения искусственно выращиваемых растительных систем, продуцирующих те же ценные биологические вещества и на том же количественном уровне, что и целое растение.
3.3 Накопление алкалоидов в культуре ткани раувольфии змеиной
Культура ткани раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina) является перспективным источником аймалина – алкалоида группы индолина, обладающего противоаритмическим действием. Аймалин содержится в смеси алкалоидов биомассы в количестве 30-40%. 40-50% составляет вомиленин – индолениновый алкалоид, который рассматривается как биогенетический предшественник аймалина. Превращение вомиленина в аймалин под действием ферментов, выделенных из клеток раувольфии, в настоящее время осуществлено in vitro и включает в себя гидрирование вомиленина и его метилирование. Источником пиридиннуклеотидов является витамин РР (никотиновая кислота и никотинамид). Перенос метильных групп осуществляется с помощью серосодержащих аминокислот – метионина и ацетилметионина.
Целью настоящей работы было выяснение влияния витамина РР, серосодержащих аминокислот, вомиленина (как предшественника аймалина) и сульфат-иона на накопление алкалоидов, в частности, аймалина в стеблевой культуре ткани раувольфии (клеточная линия А). В качестве контроля использовали регламентную питательную среду (Р). В опытных вариантах в неё вносили 2 или 5 мг/л никотиновой кислоты (среды Н2 и Н5), 10 мг/л метионина или ацетилметионина (среды М и АМ), 1 мг/л вомиленина (среда В). Вомиленин добавляли после автоклавирования среды в асептических условиях, остальные добавки вносили до автоклавирования. Среды S1 и S2 были обеднены неорганической серой: в S1 не вносили сульфат аммония; в S2, кроме того, в 5 раз уменьшили содержание сульфата магния. Опыты проводили на трёх пассажах в десятикратной повторности. После культивирования в течение 70-75 суток при 26±20 биомассу высушивали. В ней титриметрически определяли сумму алкалоидов, фотоколориметрическим методом – аймалин, хроматоспектрофотометрическом – вомиленин.
Результаты опытов приведены в таблице. Они показывают, что добавление к среде никотиновой кислоты не влияло на содержание алкалоидов в биомассе. Снижение содержания в среде сульфат-иона привело к уменьшению количества суммы алкалоидов, аймалина – в 1,5 раза, и к возрастанию (приблизительно в 2 раза) содержания в биомассе вомиленина. При введении в среду серосодержащих аминокислот в 1,2 раза увеличилось общее содержание алкалоидов в биомассе, а содержание аймалина возросло в 2 раза. Добавление вомиленина вызвало накопление в биомассе аймалина при сохранении контрольного уровня содержания суммы алкалоидов. Это вполне согласуется с литературными данными о превращении вомиленина в аймалин.
| Накопление алкалоидов в биомассе в зависимости от состава среды | ||||||||
| Количество биомассы или алкалоидов | Питательная среда | |||||||
| Р | Н2 | Н5 | S1 | S2 | М | АМ | В | |
| Биомасса, г/1л среды | 29,0±2,5 | 27,5±3,3 | 27,8±4,6 | 24,6±3,0 | 27,3±3,8 | 24,0±2,0 | 25,6±2,7 | 25,3±2,7 |
| Сумма алкалоидов | ||||||||
| Мг/1л среды | 472±31 | 490±49 | 506±36 | 310±32 | 314±24 | 463±45 | 440±38 | 416±13 |
| % к воздушно-сухой массе | 1,63±0,11 | 1,78±0,18 | 1,82±0,13 | 1,26±0,13 | 1,15±0,09 | 1,93±0,19 | 1,72±0,15 | 1,64±0,05 |
| Аймалин | ||||||||
| Мг/1л среды | 130±7 | 115±22 | 111±19 | 59±7 | 82±10 | 276±23 | 307±32 | 207±45 |
| % к воздушно-сухой массе | 0,45±0,05 | 0,42±0,08 | 0,40±0,07 | 0,24±0,05 | 0,30±0,03 | 1,15±0,12 | 1,20±0,07 | 0,82±0,18 |
| % к сумме алкалоидов | 28,8 | 23,6 | 22,1 | 19,0 | 26,1 | 59,2 | 69,8 | 50,0 |
| Вомиленин | ||||||||
| Мг/1л среды | 116±15 | 82±1 | 86±4 | 150±17 | 142±19 | 115±12 | 128±3 | 96±10 |
| % к воздушно-сухой массе | 0,40±0,05 | 0,30±0,02 | 0,31±0,03 | 0,61±0,07 | 0,52±0,07 | 0,48±0,05 | 0,50±0,01 | 0,38±0,04 |
| % к сумме алкалоидов | 24,5 | 17,0 | 17,0 | 48,4 | 45,2 | 24,8 | 29,0 | 23,1 |
Результаты исследования свидетельствуют о том, что накопление алкалоидов в биомассе связано с содержанием в среде как неорганической серы, так и серосодержащих аминокислот. Для получения обогащенной аймалином биомассы целесообразно добавлять к питательной среде метионин и ацетилметионин.
3.4 Алкалоиды каллусных тканей мака прицветникового
Мак прицветниковый (Papaver bracteatum) может быть использован c целью получения тебаина – морфинового алкалоида, являющегося предшественником кодеина и морфина. Тебаин составляет до 98% от суммы алкалоидов P.bracteatum и в лабораторных условиях легко может быть переведён в кодеин наиболее широко распространённое в мире противокашлевое средство.
Литературные данные свидетельствуют о том, что в культуре клеток растений рода Papaver доминируют алкалоиды протопионового, бензафенантридинового и тетрагидропротоберберинового типов, берущих начало от (+)-ретикулина и отсутствуют, либо присутствуют в следовых количествах алкалоиды морфинановой группы, характерные для растений это рода. При повышении уровня дифференцировки может проявляться тенденция к восстановлению спектра алкалоидов, характерного для целого растения.
Целью настоящей работы являлось получение каллусных тканей P.bracteatum, регенерантов из них и сравнение спектров алкалоидов в культуре тканей и в онтогенезе целых растений.
Штамм Р11 был способен к регенерации при культивировании по следующей схеме: каллусная ткань, выращиваемая в темноте, пересаживалась на среду, отличающуюся от исходной отсутствием гормонов, и выдерживалась в течение 30 дней в темноте. При этом в примыкающем к среде слое каллуса образовывались очаги дифференциации, которые затем пересаживали на свежую питательную среду того же состава и выставляли на свет. Через 2-3 недели внутри и на поверхности каллуса наблюдалось появление зачатков зелёных листочков, иногда образовывались корни. По мере формирования листочков регенеранты высаживали на среду Стрита для активации образования корней. При достижении корнями длины 5-10 мм регенеранты высаживали в вазоны со стерильной почвой и переносили в теплицу.
Присутствие в растительных образцах сангвинарина или тебаина определялось с помощью хроматографии хлороформного экстракта лиофилизированной ткани в тонком слое силикагеля, содержащего и не содержащего люминесцентную добавку, для раздельного определение флуоресцирующих и поглощающих зон.
Количественное определение сангвинарина в культуре тканей рассчитывали по экстинкции при 340 нм вытяжки 10%-ной H2SO4 из хлороформного экстракта лиофилизированной ткани. О количестве алкалоида, переходящего в сангвинарин, судили по разности в содержании сангвинарина в подкисленном муравьиной кислотой хлороформном экстракте до и после облучения его светом лампы ДРШ-250 в течение 1 минуты.