Теоретичні та практичні узагальнення роботи викладені у деклараційному патенті на корисну модель (№13287) та актах впровадження, які використовуються в навчальному процесі кафедр патологічної фізіології, патологічної анатомії і фармакології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, кафедрі загальної і клінічної патофізіології Одеського державного медичного університету, кафедрах патологічної фізіології, патологічної анатомії, фармакології з клінічними фармакологією та фармакотерапією, внутрішньої медицини з клінічною імунологією та алергологією Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, на кафедрах патофізіології та ендокринології, клінічної імунології і алергології Донецького державного медичного університету імені О.М. Горького, кафедрі клінічної імунології та алергології Київського національного медичного університету імені О.О. Бого-мольця.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. На основі проведеного патентно-інформаційного пошуку та літературного огляду автором, спільно з науковим керівником, сформульовано мету і завдання дослідження, вибрано і відпрацьовано адекватні моделі і методики. Під час виконання експериментальної частини здобувачем самостійно проведено моделювання хронічної гіперімунокомплексемії та її корекція, опанована і проведена методика виділення ендотеліальних клітин. Під час виконання експериментальної частини здобувач брала участь у проведенні імунологічних методів дослідження та підготовці зразків для електронної мікроскопії. Біохімічні дослідження – визначення активності ферментів NO-синтаз, вмісту нітрит – і нітрат аніонів, нітрозоглутатіону та рівнів аргінази і сечовини виконано в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна. За сприяння у виконанні біохімічних досліджень автором висловлюється щира подяка ст.н.сп., к.б.н. – Коцюрубі А.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проводились у лабораторії електронної мікроскопії ЛНМУ ім Данила Галицького, за консультативної допомоги к.б.н – В.І. Ковалишина, за що йому, автором, висловлюється щира подяка. Автором самостійно проведено статистичну обробку результатів дослідження, аналіз і узагальнення отриманих даних, написання всіх розділів дисертації та підготовку публікацій до друку. Висновки і практичні рекомендації сформульовано разом з науковим керівником. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, а також актах впровадження, що стосуються науково-практичної новизни, викладено дані, отримані автором у процесі виконання дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на науково-практичних конференціях: ”Стан і перспективи розвитку медичної генетики, алергології та клінічної імунології“ (Львів-Трускавець, 2005), ”Сучасні методи діагностики та лікування алергічних захворювань“ (Київ, 2006 ), ”ІV чтение им. В.В. Подвысоцкого“ (Одеса, 2007), ”Здобутки клінічної і експериментальної медицини“ (Тернопіль, 2007), “Роль месенжерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології“ (Тернопіль 2007), а також на Міжнародній науковій конференції “Імунодіагностика та імунотерапія ревматологічних хворих” (Львів, 2006) та ІІІ міжнародній науковій конференції ”Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка“ (Одеса, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт, з яких 8 – у фахових наукових журналах, 6 тез доповідей у матеріалах наукових з’їздів, конференцій та конгресів, 1 деклараційний патент на корисну модель.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 176 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних джерел (всього 268) і додатків. Текст дисертації ілюстрований 26 рисунками та 19 таблицями. Бібліографічний опис джерел літератури та додатки викладені на 40 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г., в осінньо-зимовий період. Експериментальні втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових досліджень (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (протокол № 15 від 12 грудня 2005 р.) порушень морально-етичних норм при виконанні науково-дослідної роботи не виявлено. У процесі дослідження використано 200 тварин, яких розподіляли на групи: перша – інтактні тварини, які отримували плацебо і служили контролем; друга – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією; третя – інтактні тварини, які отримували корвітин; четверта – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, які отримували корвітин.
Хронічну гіперімунокомплексемію відтворювали за допомогою класичного методу за Cohrane C. і Kofler D. (1973) з посиланням на праці Williams R. (1980) та досліджень Чоп’як В.В. (1998). Для цього у хвостову вену кожні 7 днів упродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін (НВФ “Simko Lpd”, Україна) із розрахунку 100 мг/кг. Розчин корвітину (виробництва ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”, Україна) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 40 мг/кг раз на добу впродовж 10 днів. Евтаназію тварин здійснювали шляхом декапітації.
Отримання клітин лімфоцитів проводили на подвійному градієнті щільності розчинів фікол-урографіну: фікол (Ficoll-400 – “Pharmacia Fine Hemical”, Швеція) урографін (Urografin – “Shering”, Німеччина) із густинами, що відповідали (с1 =1,095 г/см3 та с2 = 1,077 г/см3) (Boyum A., 1987). Ендотеліальні клітини виділяли із черевної аорти щура методом ферментативного диспергування з використанням 0,1% розчину колагенази (“Fluka Chemic A.G.“, Німеччина) (Коваленко Т.М., 1999).
Інкубацію ізольованих лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили у середовищі 199 (РАМН Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) з 20% вмістом телячої ембріональної сироватки (НВП “Cангва”, Україна) в 24 лункових пластикових планшетах (“Sigma“, США). Для запобігання змішуванню лімфоцитів та ендотеліоцитів клітини розділяли напівпроникними мембранами з діаметром пор 3мм (“Sigma“, США), виділені клітини вносились в лунку планшети у співвідношенні 1:1. Клітини інкубували в термостаті при 370 С в атмосфері із 5% СО2 впродовж 1 год (Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., 2000). Розчин корвітину, в дозі 1•10– 4 г/л, в умовах in vitro вносили в лунку планшети. Дозу застосування корвітину визначали на підставі літературних даних (Мойбенко О.О., 2000; Караванская И.Л., 2002).
Розвиток і верифікацію хронічної гіперімунокомплексемії оцінювали у сироватці крові за рівнем циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), визначення яких проводили за допомогою методу преципітації в поліетиленгліколі – 600, та загальною комплементарною активністю сироватки крові, яку визначали за методом 50% гемолізу еритроцитів (Осипов С. Г., Логинский В.Е., 1983).
Дослідження активності ферментів NO-синтаз (сNOS та іNOS) проводили калориметричним методом (Selter M., 1991). Вміст нітрит-аніонів визначали за допомогою методу Гріна в модифікації Коцюруби А.В. (Green L. S., 1982; Коцюруба А. В., 2000), нітрат аніонів методом (Bank N.R. 1993). Визначення вмісту нітрозоглутатіону (GSNO) проводили за методом (Gerdel D., 1996). Аргіназну активність визначали з допомогою спектрофотометрії (СФ-40) за методом (Gardanta C. L., 1982). Вміст сечовини в інкубаційній суміші та безбілкових зразках проб визначали калориметричним методом за допомогою добірки реактивів (ВІО-LA-TEST, МОКОVINA, “Lachema”, Чехія) та реактивів фірми (“Філіст-Діагностика“, Україна).
Дослідження ультратонкої структури лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100.
Статистичне опрацювання результатів дослідження проводили із застосуванням статистичного пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windovs.
ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Для реалізації поставленої мети, першим етапом нашої роботи було дослідження процесів NO-синтазної та аргіназної активності в ізольованих лімфоцитах та ендотеліальних клітинах при їх інкубації за умов норми і хронічної гіперімунокомплексемії.
Результати, отримані в умовах in vitro, встановили, що присутність в інкубаційному середовищі ендотеліальних клітин за умов норми здатна незначно впливати на процеси синтезу оксиду азоту в лімфоцитах. Зменшення активності іNOS (Р<0,05) компенсовано майже рівнозначним підвищенням активності сNOS (Р<0,05). Сумарна активність NOS у лімфоцитах за умов їх інкубації з ендотеліоцитами має лише тенденцію до зростання. Зміни вмісту стабільних метаболітів NO та нітрозоглутатіону (GSNO) за цих умов були недостовірними. Паралельно з цим відзначено пониження активності аргінази в 1,4 раза (Р<0,05) та зменшення вмісту сечовини у 2,9 раза (Р<0,05). У ендотеліоцитах за умов їх інкубації з лімфоцитами спостерігається зростання активності іNOS і сNOS у 2,1 раза (Р<0,001), проте дана активність ферментів не забезпечила достовірних змін у рівні нітрит - та нітрат - аніонів. У вмісті нітрозоглутатіону достовірних змін також не встановлено.