Жидкостная хроматография (ЖХ) отличается от газовой хроматографии тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость. В зависимости от характера неподвижной фазы различают твердожидкостную и жидко-жидкостную хроматографию. Вариантом колоночной ЖХ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которую называют также жидкостной хроматографией высокого давления. Характерной особенностью ВЭЖХ является то, что подвижная фаза проходит через колонку, наполненную сорбентом с большой скоростью за счет значительного давления. Метод ВЭЖХ позволяет разделять на индивидуальные вещества многокомпонентные смеси нелетучих органических соединений сложной химической структуры с различной молекулярной массой. Метод очень широко используется для идентификации и количественного определения в аналитической химии и в фармацевтическом анализе. Чувствительность ВЭЖХ достигает 10-6 г. На разделение смеси из 10—15 компонентов затрачивается 20—30 мин, причем выделяются вещества высокой степени чистоты.
Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Современные приборы оснащены устройствами, позволяющими автоматически вводить пробу, с помощью микропроцессора выполнять заданную программу хроматографического процесса, автоматически оптимизировать условия разделения и выдавать результаты, позволяющие осуществить качественную и количественную оценку анализируемой смеси веществ.
Подача элюента в колонку с заданной скоростью осуществляется с помощью насоса высокого давления до 20—50 МПа (200—500 атм) или низкого давления до 1—2 МПа (10—20 атм). Колонки для хроматографирования изготавливают из нержавеющей стали. Они имеют длину 10—25 см, внутренний диаметр 0,3—0,8 см и заполняются адсорбентом с диаметром частиц 5—10 мкм (сферической или неправильной формы). Адсорбент плотно упаковывается, что позволяет достигнуть высокоэффективного разделения смеси. Разделение производят в интервале температур 20—50° С, поддерживая ее с точностью ±0,1° С.
В приборах для ВЭЖХ используют спектрофотометрический, рефрактометрический, флуориметрический, пламенно-ионизационный, масс-спектрометрический, электрохимический и другие детекторы. Чаще всего детектором является спектрофотометр с переменной (190—900 нм) длиной волны.
Адсорбентом обычно служит силикагель либо с гидроксилированной поверхностью, либо с привитыми к поверхности различными функциональными группами. В качестве элюента используют различные углеводороды, добавляя к ним небольшие количества этанола или других растворителей. В обращенно-фазной ВЭЖХ колонки заполняют силикагелем с привитыми гидрофобными группами, а в качестве элюента берут водные растворы низших спиртов или ацетонитрил. В тех же условиях применяют ионпарную ВЭЖХ для разделения органических кислот, оснований и их солей, но в этом случае к элюенту добавляют ионные соединения, анион или катион которых содержит гидрофобную группу. Ионообменную ВЭЖХ применяют для разделения органических катионов и анионов, используя в качестве адсорбентов соединения, содержащие сульфо-группы, карбоксильные или аминогруппы разной основности. Элюентами служат водные буферные растворы с различным рН.
Вещества, способные образовывать комплексы с катионами металлов (например, оптические изомеры аминокислот), разделяют с помощью лигандообменной ВЭЖХ. Адсорбентами при этом служат соединения, способные образовывать комплексы с ионами металлов и разделяемым веществом.
Одной из разновидностей метода является микроколоночная жидкостная хроматография, представляющая собой универсальный ультрачувствительный и высокоэкономичный вариант ВЭЖХ. Принципиальное его отличие заключается в использовании микроколонок объемом около 200 мкл и спектрофотометра с объемом проточной кюветы 1 мкл в качестве детектора. В Российской Федерации выпускается микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром".
Метод ВЭЖХ успешно применен для качественной и количественной оценки ряда наркотических, ядовитых и сильнодействующих лекарственных веществ. С этой целью перспективно использование таких параметров, как время удерживания, коэффициент емкости, интегральные спектральные отношения (А.Х.Лайпанов). В нашей стране метод ВЭЖХ рекомендован во всех ФС, разработанных на стандартные образцы антибиотиков. В Фармакопее США (XII издание) метод ВЭЖХ применен для анализа большинства антибиотиков противоопухолевого действия и цефалоспоринового ряда.
Ряд преимуществ по сравнению с ГЖХ и ВЭЖХ имеет занимающая промежуточное положение между этими методами сверхкритическая флюидная хроматография. Преимущества метода заключаются в возможности разделения неустойчивых и нелетучих веществ, универсальном детектировании и высокой экспрессности. Так, например, сочетание сверхкритической флюидной хроматографии с УФ-детектором позволяет детектировать 40 алкалоидов в одном растении.
Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация, молекулярно-ситовая фильтрация, гельпроникающая хроматография) — вид жидкостной распределительной хроматографии, в процессе которой разделение происходит по размерам молекул. В гель-фильтрации элюентом служит вода, а в гельпроникающей хроматографии — органический растворитель. Неподвижной фазой являются пористые материалы с определенным узким распределением пор по диаметру. Исследуемое вещество, диаметр которого превышает диаметр пор, не может диффундировать внутрь таких сорбентов. Поэтому оно проходит через колонку быстрее, чем молекулы с меньшим размером, которые проникают в поры. Таким образом обеспечивается разделение молекул в зависимости от их размера. Поры внутри геля заполнены жидкостью, которая занимает большую часть его объема. Применяют гели на основе декстрана, агарозы, полиакриламида. Метод может быть использован для определения молекулярной массы, а также для исследования, очистки и разделения веществ с молекулярной массой 102—108. Осуществляют эксклюзионную хроматографию в жидкостных хроматографах.
Колонки заполняют различными сорбентами: мягкими (сефадексы), полужесткими (полиакриламидные гели), жесткими (пористые стекла). Детектором служит проточный рефрактометр или спектрофотометр. В отличие от других видов хроматографии на выполнение испытания требуются небольшие затраты времени.
Количественное содержание каждого компонента смеси можно установить используя метод внутреннего стандарта или абсолютной калибровки, т.е. так же, как в ГЖХ. Время выхода каждого компонента из колонки в идентичных условиях разделения является постоянной величиной и может служить для идентификации вещества. Площадь пика пропорциональна количеству компонента и поэтому используется для определения его содержания в смеси.
Полибуферное распределение в фармацевтическом анализе применяют для разделения смесей веществ. Оно может быть использовано в анализе лекарственных форм, представляющих смеси оснований или кислот, для разделения смесей аминов, алкалоидов, органических кислот, фенолов, антибиотиков, а также для отделения веществ, диссоциирующих на ионы, от не диссоциирующих.
Экстракцию как метод разделения применяют в фармацевтическом анализе, особенно для разделения компонентов, входящих в состав лекарственных форм. В зависимости от исходной фазы различают экстракцию из твердого вещества и экстракцию из раствора (жидкостную), а по количеству операций — однократную и многократную экстракции. Основное условие разделения — выбор экстрагента, не смешивающегося с исходной фазой и легко отделяющегося от нее и от экстрагируемого вещества. Экстракцию как метод разделения сочетают с фотометрией.
Экстракционно - фотометрический метод основан на образовании цветных продуктов, способных экстрагироваться каким-либо органическим растворителем. Этот метод используют для анализа многих препаратов и лекарственных форм. Метод включен в ГФ XI, зарубежные фармакопеи.
Для экстракционно-фотометрического определения алифатических, ароматических, гетероциклических азотсодержащих лекарственных веществ используют различные группы кислотных красителей: азокрасители (метиловый оранжевый, магнезон ИРЕА, кислотный хром темно-синий, тропеолин 00), сульфофталеиновые красители (бромфеноловый синий, бромтимоловый синий, бромкрезоловый зеленый, бромкрезоловый пурпуровый, тимоловый синий, пирокатехиновый фиолетовый, ксиленоловый оранжевый), оксиксантеновые красители (эозин, эритрозин, флоксин, бенгальский розовый А и Б). Указанные красители образуют с азотсодержащими соединениями и их солями окрашенные комплексы или ионные ассоциаты, растворы которых отличаются высокими значениями молярных коэффициентов поглощения, что позволяет определять малые количества веществ. Окрашенные вещества экстрагируют в органическую фазу (обычно в хлороформ) и измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра или фотоколориметра.
Чаще всего измеряют оптическую плотность раствора ионного ассоциата в органическом растворителе. Но в ряде случаев полученный ассоциат разрушают введением кислоты в органическую фазу или путем реэкстракции красителя водными растворами кислот или оснований, а затем измеряют абсорбцию свободного красителя. Анализ выполняют при оптимальном значении рН водной среды, которую устанавливают экспериментально для каждого испытуемого препарата. Наряду со стехиометрическим вариантом экстракционно-фотометрического метода применяют также субстехиометрический, сущность которого состоит в однократном экстрагировании ионного ассоциата, что в значительной степени упрощает методику выполнения анализа и сокращает время его выполнения.
Аминопроизводные соединения алифатического, ароматического и гетероциклического ряда ввиду наличия неподеленной пары электронов атома азота имеют высокую реакционную способность. Они, в частности, вступают в реакции с комплексными металлокислотами.