Майерс и Смит описали методику биоавтографического анализа на незакрепленных слоях эритромицина и других антибиотиков. После завершения разделения хроматограммы сушат и покрывают увлажненной фильтровальной бумагой, положенной на чистую стеклянную пластинку. Затем хроматографиче-скую пластинку переворачивают и края фильтровальной бумаги загибают назад, «а носитель слоя. Удалив .наружную стеклянную пластинку, прижимают бумагу, покрывающую слой, к зернистому слою агара (авторы приводят подробную методику приготовления такого слоя агара с использованием Streptococcus lactis) и выдерживают 2 ч при 37 °С.
Истербрук и Херсей разработали метод тонкослойного анализа эритромицина и его эфиров с Sarcina lutea ATCC 9341 в качестве организма для испытания. Площадь зоны торможения измеряли, проецируя изображение на экран при 12-кратном увеличении. Установлена линейная зависимость между логарифмом концентрации вещества и корнем квадратным из площади пятна. Чувствительность определения на слоях, нанесенных на алюминий, колеблется в пределах от 0,03 мкг для оснований и стеаратов и до 0,05 мкг для эстолатов. Системами разделения служили системы Ричарда и др. ; пластинки предварительно промывались.
ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Насбаумер разделил пенициллины после кислотного гидролиза. Анализируя продукт разложения пенициллина, он исследовал влияние 40 различных компонентов на идентификацию пенициллияов методом ТСХ. Этот же автор изучил возможность спектрофотометрического определения пенициллинов в различных фармацевтических препаратах. Прямому анализу этих антибиотиков мешают полиэтиленгликоли и стеараты натрия, однако предварительное разделение методом ТСХ позволяет отделить пенициллины от мешающих анализу соединений. Слои для хроматографического разделения приготавливают так: смешивают 20 % рисового крахмала с силикагелем G в фосфатном буфере (рН 5,8). Элюирование проводят смесью бутилацетат—н-бутанол—уксусная кислота—фосфатный буфер (рН 5,8) — метанол (80 : 15 : 40 : 24 : 5).
Мак-Гильверей и Стрикленд разделили группу пенициллинов на слоях целлюлозы MN 300 и на слоях силикагеля G. Для разделения ампициллина и гетациллина на слоях силикагеля вполне пригодна также смесь ацетон—ускусная кислота. Эти системы не позволяют отделить диклоксациллин от нафциллина или фенициллин от феноксиметилпенициллина. Нафциллин можно обнаружить по интенсивной желтой окраске, которую он дает с 50 %-ной серной кислотой. Кроме нафциллина желтую окраску дает только метициллин, но у него другая величина Rf. Биаджи и др. исследовали влияние рН на разделение методом ТСХ с обращением фаз пенициллинов и сефалоспоринов. Экстраполированные величины RM для пенициллинов приведены в табл. 18.6. Аутергофф и Кинцлер делили пенициллины на силикагеле G, элюируя пробу смесью бензол—этилформиат— муравьиная кислота (80:15:6). Продукты расщепления окса-циллина и феноксиметилпенициллина были проанализированы хроматографически Корчагиным и сотрудниками . Вандамм и Фоетс использовали 4 следующие смеси растворителей при разделении продуктов спонтанного химического и ферментативного разложения пенициллинов и двух цефалоспоринов на силикагеле G: н-бутанол—вода—этанол—уксусная кислота (5:2:1,5:1,5), н-бутанол—вода—уксусная кислота (4:1:1), ацетон—уксусная кислота (19:1) и 85 %-ный ацетон.
Манни и др. применили метод измерения отражательной способности in situ для определения натрийпенициллина G в фармацевтических препаратах. После хроматографического разделения на силикагеле со смесью ацетон—хлороформ—уксусная кислота (10:9: 1) авторы измеряли отражательную способность пятен в области 230 нм. Стандартное отклонение составило 5% для зон, содержавших 1 мкг пробы, и 1,5% для зон, содержавших 10 мкг. Синсхаймер и др. определяли флуоресцентным методом in situ следы пенициллина. Бензил-пенициллин гидролизовали пенициллиназой, подвергали затем хроматографическому разделению на силикагеле G со смесью диметилформамид—хлороформ—28 %-ный аммиак (10:5:4) и измеряли при 510 нм интенсивность флуоресценции пятна с Rf 0,50 (длина волны возбуждающего излучения составляла 410 нм). Интенсивность флуоресценции пятен феноксиметил-пенициллина, полученного в результате гидролиза (Rf 0,88), измеряли в области 480 ом при длине волны возбуждающего излучения 260 нм. Метициллин гидролизовали и измеряли интенсивность флуоресценции пятна с Rf 0,73 при 480 нм при возбуждающем излучении 350 нм. Пределы чувствительности в перечисленных выше определениях равны 3, 0,76 и 0,12 мкг соответственно. Пенициллановую кислоту определяли методом флуоресцентной денситометрии пятна с Rf 0,45 при 440 нм с возбуждением при 350 нм. В этом случае после разделения на силикагеле смесью хлороформ—этилацетат—муравьиная кислота (60:40: 1) пластинку выдерживали 3 мин в парах аммиака, чтобы образовался флуоресцирующий продукт. Полуколичественное определение пенициллинов и продуктов их превращения проводили визуально, сравнивая размеры пятен и их окраску .
Цефалоспорин В и некоторые из его производных анализировали хроматографически на силикагеле G, используя смесь н-бутанол—уксусная кислота (10:1), насыщенную водой, а также смесь н-бутанол—пиридин—уксусная кислота—вода (17:12:4:15) . Для некоторых специфических соединений применяли различные комбинации ацетона с бензолом (1:4; 2 : 3) и толуолом (2:3; 1 : 4; 3 : 7; 1 : 9), а также толуола и этил-ацетата (1:1). Биаджи и др. разделили методом ТСХ с обращением фаз 13 цефалоспоринов. Разделение эти авторы проводили на силикагеле, пропитанном силиконом, применяя буферный раствор (рН 7,4) ацетат натрия—веронал, содержавший от 0 до 24 % ацетона. По полученным данным были рассчитаны величины RM. Бури хроматографировал цефалоспорин В, цефалотин и цефалоридин на слоях силикагеля, забуференных фосфатным буфером (рН 5,8), элюируя их смесью изопропанол – метанол – фосфатный буфер с рН 5,8 (2:7:1).
РИФАМИЦИНЫ
Эти антибиотики разделяли с помощью ряда спиртов и ацетона на слоях силикагеля G . Ацетон оказался лучшим растворителем; проводя элюирование ацетоном, удается отделить рифамицин В от рифамицина О, рифамицин SV от ри-фамицина S, а рифамицин В от рифамицина SV. Эти соединения интенсивно окрашены, и поэтому при достаточно высоких концентрациях их можно обнаружить на пластинках, не применяя реактив. Однако микробиологическим методом их можно обнаружить при гораздо более низких концентрациях. Для 2 — 20 мкг рифамицина и дезацетилрифамицина Колос и Эйдус приводят величины Rf (0,55 и 0,37 соответственно), полученные при хроматографировании смесью хлороформ—этанол—0,1 н. соляная кислота (84:15,9:0,1) на хроматографических полосах № 6060 фирмы Eastman. Меджи и др. провели хроматографический анализ группы полусинтетических рифамицинов на силикагеле с ацетоном.
ТЕТРАЦИКЛИНЫ
Николаус и др. исследовали также разделение тетрациклинов на тонких слоях силикагеля G. Они изучили большое число растворителей; четыре лучших растворителя указаны в табл. 1.2, там же даны соответствующие величины Rf. В дополнение к приведенным в таблице результатам следует указать, что окситетрациклин и диметилтетрациклин можно отделить от тетрациклина, хлортетрациклина и дезокситетрациклина, элюируя смесь 10 %-ным раствором лимонной кислоты, насыщенным бутанолом. Обнаруживают тетрациклины, опрыскивая пластинки 1 н. соляной кислотой и затем нагревая их при 50 °С. Тетрациклины обнаруживают в виде желтых пятен. Для обнаружения дезокситетрациклина используют реакцию сочетания с солью диазония. При проведении микробиологической пробы агар заражают Bacterium subtilis.
Таблица 2.1
Величины Rf X 100 некоторых тетрациклинов, полученные с различными хроматографическими системами
| Соединение | Силикагель | Кизельгур | |||||
| А | Б | В | Г | Д | Е | Ж | |
| ТетрациклинХлортетрациклинАнгидротетрациклинОкситетрациклинАнгидрохлортетрациклинДиметилхлортетрациклинМетациклинДоксициклин4-ЭпитетрациклинЭпиангидротетрациклин4-Эпихлортетрациклин | 36300-20580-20 | 3843454146 | 6172687075 | 5060505552 | 5376936083734453204733 | 3660832057442927125021 | РоРоРоЖРоРоРо-КоРо-КоЖЖ-РоЖ-Ро |
Авторы работы разделяли тетрациклин, хлортетрациклин, диметилхлортетрациклин и их ангидро- и эпипроизводные на промытом кислотой кизельгуре G, пропитанном 20 %-ным раствором полиэтиленоксидгликоля 400 в смеси глицерин — 0,1 М ЭДТА при рН 7 (1 : 19). Разделяющим растворителем был органический слой смеси этилацетат — 0,1 М ЭДТА, рН 7 (6:1). При рассмотрении пластинок в длинноволновом УФ-свете можно обнаружить 0,05 мкг антибиотика. В работе описана методика разделения тетрациклинов и продуктов их превращения на кизельгуре, пропитанном ЭДТА; величины Rf и применявшиеся растворители указаны в табл. 1.2.
Количественное определение ангидротетрациклинов в разложившихся таблетках тетрациклина проводили, экстрагируя зоны ТСХ и измеряя коэффициент поглощения при 428 нм . При определении эпитетрациклина и хлортетрациклина зону первого соскребали, элюировали 0,1 н. соляной кислотой и измеряли поглощение элюента при 356 нм. Хлортетрациклин после элюирования 0,2 н. гидроксидом натрия измеряли по интенсивности флуоресценции в области 414 нм (длина возбуждающего излучения 356 нм). Радека и Вильсон проводили определение тетрациклина в фармацевтических препаратах in situ. Хотя этот метод менее точен, чем спектрофотометрический метод Альварца Фернандеца и др., он более чувствителен, требует меньше времени и более точен, чем официальные микробиологические методы. Ван Хоек и др. разработали для этой группы соединений флуорометрический метод определения in situ.
ПЕПТИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ
Полимиксиновые антибиотики представляют собой пептиды очень близкого строения. Кроме аминокислот в их молекулу входят жирные кислоты. Иглой и др.разделяли поли-миксины В, D и М на силикагеле G, используя смесь ацетон— вода—уксусная кислота—2 н. гидроксид аммония (15:5:1:2). Полимиксин Е (колистин) не удается отделить от полимик-сина В. Хоулетт и Зельцер разработали метод дифференциации этих двух соединений: пробу гидролизуют 5 н. соляной кислотой в запаянной трубке 6 ч при 120°С и определяют аминокислотный состав хроматографически в камере с насыщенной атмосферой на слое силикагеля MNG, используя раствор 68 мг иодида калия в 84 мл 90 %-ного фенола и 16 мл воды. Нингид-риновая проба позволяет обнаружить L-2,4-диаминомасляную кислоту, L-треонин, фенилаланин и лейцин в пробе полимиксина В, в то же время при хроматографировании колистина пятно фенилаланина обнаружено не было. Хамерс и Моерлуз предпочитают проводить 22-часовой гидролиз при ПО "С, чтобы избежать появления ложных пятен.