ВВЕДЕНИЕ
Для идентификации антибиотиков и их отнесения к той или иной группе антибактериальных препаратов служит ряд хроматографических методов. До недавнего времени наиболее распространенным методом была бумажная хроматография (восходящая, нисходящая, круговая, центрифужная, одно- и двумерная бумажная хроматография, хроматография на бумаге, пропитанной буферами, на ионообменной бумаге и т. п.), однако впоследствии широкое распространение получила также ТСХ (преимущественно на силикагеле или на оксиде алюминия), отличающаяся простотой аппаратурного оформления и высокой скоростью анализа . Чтобы придать сорбенту определенные свойства, его можно предварительно обработать соответствующим реагентом. Например, для разделения тетрациклинов, способных образовывать хелаты, Нишимото и др. использовали пластинки с силикагелем, пропитанным раствором динатриевой соли ЭДТА. Известны примеры хроматографическогоанализа антибиотиков на пластинках с целлюлозой, сефадексом и активным углем.
Для идентификации многих антибиотиков можно использовать также электрофорез и противоточное распределение. Что же касается разделения и идентификации антибиотиков с помощью ГЖХ то в последние годы этот метод в значительной степени заменен на ВЭЖХ, основные преимущества которой заключаются в том, что она обеспечивает высокую скорость и эффективность разделения и детектирование элюата не сопряжено с разрушением компонентов анализируемой смеси. Вместе с тем ВЭЖХ не лишена и некоторых недостатков: во-первых, при переходе от одного антибиотика к другому часто бывает необходимо менять систему растворителей и режим детектирования, и, во-вторых, ВЭЖХ в отличие от бумажной и тонкослойной хроматографии не позволяет одновременно анализировать несколько смесей.
Лишь для небольшого числа из тысяч известных антибиотиков разработаны системы классификации и идентификации. В работе на основании данных ТСХ и биоавтографии предложена классификация 151 антибиотика, обладающего противоопухолевой активностью; в работах для классификации 91 антибиотика использован метод «мгновенной ТСХ», а в работе рассмотрены вопросы, связанные с применением ТСХ-систем для классификации и идентификации антибиотиков. Существуют два справочника по хроматографии антибиотиков. В «Руководстве по хроматографии» приведены таблицы с данными по хроматографическим свойствам этих соединений. Описание ТСХ-методик можно найти в подробном обзоре Лотта и др.
Методы обнаружения антибиотиков на протяжении ряда лет практически не претерпели никаких изменений. Обычно они включают биоавтографию с помощью чувствительных к данному антибиотику микроорганизмов, посеянных на агаре, или проявление хроматограмм путем их опрыскивания растворами соответствующих реагентов с последующим просмотром при УФ-освещении. Для обнаружения антибиотиков наиболее пригоден метод биоавтографии, суть которого заключается в следующем. Высушенную бумажную хроматограмму, тонкослойную пластинпластинку или электрофореграмму прижимают к поверхности агара, содержащего культуру подходящего микроорганизма, и выдерживают в течение определенного времени. За время инкубации число бактерий увеличивается лишь в тех участках агара, которые не соприкасались с антибиотиком. По положению зон, в которых подавляется рост бактерий, определяют значения Rf соединений, проявляющих свойства антибиотика. Мейерс и Чанг предложили способ увеличения чувствительности обнаружения антибиотиков с помощью Trichomonas, основанный на использовании монофосфата фенолфталеина.
В этой курсовой работе мы не будем углубляться в вопросы, касающиеся препаративной хроматографии, а ограничимся лишь описанием методологии идентификации антибиотиков.
МЕТАБОЛИТЫ АКТИНОМИЦЕТОВ
Метод ТСХ применяли для выделения, очистки и идентификации различных продуктов метаболизма актиномицетов. Бек и др. приводят величины Rf для нонактина и некоторых его гомологов, полученные на силикагеле G со смесью хлороформ—этилацетат (1:2): нонактин 0,62, монактин 0,48, динактин 0,32 и тринактин 0,15. Бикель и др. установили значения Rf акумицина и ряда стандартных антибиотиков в трех различных растворителях на силикагеле G (табл. 1.1).
Таблица 1.1
Величины Rf X 100 акумицина и стандартных антибиотиков группы макролидов, полученные на силикагеле G
| Антибиотики | Метанол | Хлороформ-метанол (95:5) | Хлороформ-метанол (1:1) |
| АкумицинАнголамицинТилозинКарбомицинФоромацидин АФоромацидин ВФоромацидин СЭритромицинНарбомицинПикромицинЛанкамицин | 6665687532343716222274 | 3518740256312737 | 8282818859616429413687 |
Обнаружение пятен они проводили обработкой серной кислотой или методом биоавтографии. С этой целью на поверхность заряженного бактериями слоя агарового студня помещали слои фильтровальной бумаги, после чего к бумаге прижимали в течение примерно 20 мин пластинку размером 20X20 см с усилием около 2 кг. Слой агара инкубировали от 16 до 18 ч при 37 °С.
Кассани и др. описали хроматографический анализ актиномицина на силикагеле и оксиде алюминия. Отделить группу С от группы F можно на силикагеле с помощью ряда различных растворителей, среди которых лучшим оказалась смесь бутанол—уксусная кислота—вода (10 : 1 : 3); в этой смеси Rf для группы F равна 0,5, а для группы С — 0,7 при длине пути разделения 15 см. Отдельные соединения можно выделить на оксиде алюминия, проводя элюирование нижним слоем смеси растворителей этилацетат—симм-тетрахлорэтан—вода (3:1:3); при этом (длина пути разделения 12,5 см) получены следующие величины Rf : d — 0,44; С2 — 0,51; С3 — 0,58;" Fi — 0,21 и F2 — 0,35; эти соединения легко обнаружить по ярко-оранжевой окраске при наблюдении в УФ-свете.
Кондо и др. провели разделение водорастворимых основных антибиотиков, продуцируемых стрептомицинами на активном угле, используя четыре типа пластинок из нейтрального и подкисленного активного угля с гипсом в качестве связующего и без него. Лучшие результаты получены на подкисленном угле. Для незакрепленных слоев суспензию готовили, смешивая 10 г активного угля, 30 мл 0,5 н. соляной кислоты и 30 мл метанола. Для слоев, содержащих гипс в качестве связующего, добавляли 0,5 г гипса и серную кислоту заменяли на соляную. Исследовали шесть смесей; лучшие результаты получены для смеси метанол—0,5 н. кислота (1:4) с добавкой соляной или серной кислот в зависимости от того, какую из кислот использовали при приготовлении золя для тонкослойного покрытия. Таким методом антибиотики были разделены на 4 группы: стрептомицин, стрептотрицин, фрадиомицин и канамицин. Насбаумер и Шордере использовали тонкие слои силикагеля со смесями н-бутанол—вода—метанол (40 : 20 : 10) + n-толуолсульфокислота для идентификации стрептомицина и дигидрострептомицина.
Катаяма и Икеда разработали методику двумерного разделения стрептомицинов, сочетающую ТСХ на силикагеле и последующий электрофорез. Полного разделения всех компонентов удалось достичь методом ТСХ в четыре этапа, используя 1) насыщенный водой бутанол, содержащий по 2% п-толуол сульфокислоты и пиперидина (растворитель Si), с последующим электрофорезом в 1 %-ном тетраборате натрия; 2) ТСХ с 3 %-ным ацетатом натрия (растворитель S2) с последующим электрофорезом в 1 %-ном тетраборате натрия; 3) ТСХ с S2 с последующим электрофорезом в буфере Михаэлиса—Веронала, рН 8,0, и 4) ТСХ с S2 с последующим электрофорезом в 0,04 М буферном растворе формиата аммония, рН 3. Соединения обнаруживали реактивом Т-239.
Стрептомицин, дигидродезоксистрептомищин. и дигидростреп-томицин делили на силикагеле, элюируя 3 %- или 4 %-ным ацетатом натрия . Стрептомицин и другие туберкулостатиче-ские антибиотики (канамицин, виомицин, циклозерин, рифами-цин SV и капреомицин) разделяли вначале смесью ацетон— 2 %-ный ацетат натрия (9:1), а затем смесью н-бутанол—пиридин—метанол—уксусная кислота—вода (30 : 20: 20 : 1 :30) на силикагеле G.
Боровицкая делила стрептомицин, неомицин, канамицин, паромомицин, гентамицин, мицерин (форма неомицина), фрамицетин и линкомицин на слоях силикагель—кизельгур (1:2), применяя смесь метанол—этилацетат—вода— 25 %-ный аммиак—пиридин—3,85 %-ный ацетат аммония (10:2:6:2: 1 :20).
Келлер-Ширлайн и Ронкари исследовали гидролиз продуктов ланкамицина.
ЭРИТРОМИЦИНЫ
Андерсон разделял эти антибиотики на тонких слоях силикагеля, элюируя смесью метиленхлорид—метанол—бензол— формамид (80:20:20:2—5). Влажность атмосферы лаборатории определяет процентное содержание формамида в раство-. рителе. Чем выше влажность, тем меньше требуется формамида для разделения. Так, при 20 %-ной ОВ (относительная влажность) требуется 5 объемов формамида, а при 30—40 %-ной — 3—2 объема. Пятна обнаруживали опрыскиванием 10 %-ной фосфомолибденовой кислотой в этаноле или 50 %-ным раствором серной кислоты. В обоих случаях после опрыскивания пластинки нагревали на горячей плитке. Фосфомолибденовая кислота — более чувствительный реактив, но обработанные ею пятна обесцвечиваются через 1—2 ч, поэтому, если хромато-грамму нужно сохранить, следует предпочесть обугливание серной кислотой.
Мальчевска-Конецка и др. разделяли эритромицины А и С и ангидроэритромицин на силикагеле, используя верхний слой смеси этилацетат—изопропанол—15 %-ный ацетат аммония (9:7:8), рН которого доведен до 10,1. Обнаружение прово проводили смесью 0,15 %-ный раствор ксантидрола в смеси соляная кислота—уксусная кислота (12:1). Чувствительность определения составляла 0,05 мкг. Ричард и др. использовали смеси метанол — 0,02 н. ацетат натрия (4:1) на силикагеле G, приготовленном с 0,02 н. ацетатом натрия, для отделения эритромицина, эстолата эритромицина и этилсукцината эритромицина от некоторых продуктов разложения и фармацевтических сопутствующих продуктов. Эти же авторы определили Rf 23 других антибиотиков. Радецка и др. [26] применили прямой денситометрический метод для определения эритромицина и эстолата эритромицина в капсулах с теми же разделяющими средами. Обнаружение осуществляли реактивом Т-139. Точность данных колебалась от 2,1 до 3,4 % при чувствительности определения 5 мкг.