Методы клинической вирусологии (стр. 3 из 5)

Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25—48 ч при 4 °С.

5.1.2 Предварительная обработка сыворотки

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-глютинации, которые следует удалить. Неспецифические ингибиторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином. В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.

1. В стеклянные пронумерованные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.

2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере.

3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин 20 мин.

5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.

5.1.3 Реакция торможения гемагглютинации

1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок.

2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.

3. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

4. В лунки 1—10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 ГА-антиген краснухи не добавляют.

5. В лунки 1—8 другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.

6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.

7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1 — 1,5 ч при 4 °С.

8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи. В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.

9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.

10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.

5.1.4 Интерпретация результатов

При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.

5.2 Реакция связывания комплемента

Принцип реакции связывания комплемента основан на том, что взаимодействие антител с вирусными антигенами приводит к активации, а следовательно, к связыванию комплемента. Остающийся комплемент можно обнаружить, используя эритроциты барана, сенсибилизированные антиэритроцитарными антителами. Эти антитела обычно называют гемолизинами и получают из сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Несвязавшийся комплемент вызывает лизис эритроцитов. В случае связывания комплемента в первой реакции лизиса эритроцитов барана не происходит.

Таким образом, количество специфических антител в сыворотке можно определить при тестировании ее последовательных разведений с известным микробиологическим антигеном в присутствии комплемента и с последующим добавлением сенсибилизированных эритроцитов барана.

Для получения достоверных воспроизводимых результатов необходимо строго соблюдать пропорции используемых реагентов. Поэтому перед постановкой реакции необходимо определить соответствующие концентрации комплемента, гемолитической сыворотки и антигена. Ниже мы приводим пример определения специфических антител к вирусу краснухи в РСК-

5.2.1 Титрование комплемента и гемолитической сыворотки

Здесь так же, как и в РТГА, используют полистироловые 96-луночные планшеты с U-образным дном и микротитратор

Постановка реакции

1. Растворяют в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды лиофилизированный препарат комплемента.

2. Нумеруют восемь стеклянных пробирок.

3. Готовят 60-кратное разведение комплемента в первой пробирке. Для этого 0,1 мл комплемента разводят 0,7 мл дистиллированной воды и 4,0 мл вероналового буферного раствора. Лиофилизированный комплемент содержит криопротектор, поэтому добавление 0,7 мл дистиллированной воды к 0,1 мл растворенного комплемента дает 10-кратное разведение.

4. В оставшиеся семь пробирок вносят по 0,4 мл VBS.

5. 1,6 мл содержимого первой пробирки переносят во вторую, перемешивают, затем из второй переносят 1,6 мл в третью и т.д. до восьмой пробирки. Перед каждым переносом пипетку промывают в VBS. Таким образом получают последовательные разведения комплемента с 20%-ной разницей между ними, т.е. 1:60, 1:75, 1:94, 1:118, 1:148, 1:184, 1:230, 1:288.

6. Размечают 96-луночный планшет, как указано на рис. 5.

7. В лунки 1—8 рядов 1—7 вносят по два объема VBS.

8. В лунки 9 рядов 1—6 вносят по три объема VBS.

9. В лунки 1—8 рядов 1—7 добавляют по одному объему приготовленных разведений комплемента.

10. Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4°С.

На следующее утро готовят последовательные двукратные разведения гемолитической сыворотки от 1:25 до 1: 800; в особую пробирку вносят 1 мл VBS. В пробирку 1 вносят 2,4 мл VBS и 0,1 мл гемолитической сыворотки. По 1 мл VBS добавляют в пробирки 2—6. Из первой пробирки переносят 1 мл во вторую пробирку и т.д. до шестой пробирки, промывая пипетку после каждого переноса. Удаляют 0,5 мл из первой пробирки и 1 мл из шестой пробирки для того, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составил 1 мл.

12. Эритроциты барана трижды промывают в VBS.

13. Затем супернатант сливают и эритроциты суспендируют б оставшемся объеме жидкости.

14. Определяют объем полученной суспензии эритроцитов и разводят ее VBS до получения 4%-ной суспензии.

15. По 1 мл суспензии эритроцитов добавляют в семь соответственно помеченных пробирок, следуемых за рядом пробирок с разведенной гемолитической сывороткой, а также в контрольную пробирку.

16. Суспензии эритроцитов смешивают с соответствующими разведениями гемолизина, закрывают пробирки и инкубируют 20 мин на водяной бане при 37 °С.

17. В то же время в термостате или термальной комнате разогревают приготовленный накануне планшет для микротитрования.

18. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и по одному объему каждого разведения вносят в соответствующий ряд лунок.

19. Ресуспендируют содержимое лунок, постукивая по планшету, и оставляют его на 30 мин при 37 °С. Через 15 мин инкубирования необходимо повторно суспендировать клетки встряхиванием планшета.

20. Для получения окончательного результата планшет выдерживают примерно 90 мин при 4°С.

Интерпретация полученных результатов. На рис. 5 показан типичный результат тестирования. Отсутствие гемолиза в контрольных лунках с комплементом и гемолизирующей сывороткой свидетельствует об отсутствии неспецифического лизиса.

Оптимальной сенсибилизирующей концентрацией гемолитической сыворотки считают ее разведение, обеспечивающее наибольший лизис при максимальном разведении комплемента. На рис. 5 ОСК составляет 1: 100. В описанных ниже опытах гемолитическую сыворотку используют именно в этом разведении.

Разведение комплемента, обеспечивающее 50%-ный лизис при ОСК гемолитической сыворотки содержит одну единицу комплемента - На рис. 5 EKsoсодержится в разведении 1:184, поэтому для тестирования следует использовать комплемент в разведении 1: 60.

5.2.2 Титрование связывающего комплемент антигена вируса краснухи с положительной контрольной сывороткой

Постановка титрования. 1. Разводят лиофилизированный СК-ан-тиген вируса краснухи дистиллированной водой до указанной в инструкции концентрации.

2. Нумеруют шесть пробирок.

3. В пробирку 1 вносят 0,2 мл антигена вируса краснухи и 0,8 мл VBS.

4. В пробирки 2—6 добавляют по 0,5 мл VBS.

5. Из первой пробирки во вторую переносят 0,5 мл и т.д. до шестой пробирки, получая таким образом последовательные разведения антигена 1:5, 1: 10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160.

6. Разводят лиофилизированный препарат заведомо положительной антисыворотки дистиллированной водой.

7. К 0,1 мл сыворотки добавляют 3,9 мл VBS.

8. Готовят последовательные двукратные разведения антисыворотки на VBS.

9. Размечают полистироловый 96-луночный планшет, как показано на рис. 6.

10. В каждую лунку, содержащую контрольную антисыворотку, и в каждую лунку, содержащую контрольный антиген, вносят по одному объему VBS.

В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения сыворотки.

12. В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения антигена.

13. В каждую лунку вносят по одному объему разведения, содержащего ЗЕКбо-

14. Для проверки правильности выбора концентрации комплемента в четыре контрольные лунки вносят 6, 3, 1,5 и 0,75 ЕК.50 соответственно. Далее проводят следующие операции: