Методы клинической вирусологии (стр. 4 из 5)
а) в лунки рядов 1, 3, 4 добавляют по одному объему VBS; в лунки ряда 2 — два объема VBS;
б) в лунки ряда 1 добавляют два объема комплемента, а в лунки рядов 2 и 3 — по одному объему комплемента;
в) с помощью микротитратора переносят 0,025 мл из лунок ряда 3 в лунку ряда 4;
г) из лунок ряда 4 микротитратором удаляют 0,025 мл;
д) в лунки рядов 3 и 4 вносят по два объема VBS. 14. Планшет оставляют на ночь при 4°С.
16. Утром планшет выдерживают 30 мин при 37°С.
17. Готовят 4%-ную суспензию эритроцитов барана; 2,5 мл этой суспензии смешивают с равным объемом гемолизина, разведенного в VBS до ОСК. Гемолизин добавляют при постоянном перемешивании, переворачивая пробирки 10—12 раз. Сенсибилизированные эритроциты инкубируют в водяной бане 30 мин при 37 °С.
18. В каждую использованную лунку планшета добавляют по одному объему сенсибилизированных эритроцитов.
19. Для перемешивания планшет покачивают, затем накрывают крышкой и инкубируют 15 мин при 37°С. Затем содержимое лунок еще раз перемешивают, покачивая планшет, и продолжают инкубацию еще 15 мин.
20. Для получения окончательного результата планшет выдерживают около 90 мин при 4 °С.
Интерпретация полученных результатов. На рис. 6 показан типичный результат тестирования. Контроль комплемента свидетельствует о правильности выбора концентрации комплемента. Контроль антигена и антисыворотки свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антигел — антитело.
Оптимальным разведением СК-антигена вируса краснухи считают разведение, обеспечивающее максимальное связывание комплемента при наибольшем разведении сыворотки. В нашем примере таким разведением является разведение
1:20. Его и следует использовать при тестировании неизвестной сыворотки.
В рассматриваемом случае титр положительной сыворотки равен 160, т. е. обратной величине разведения, позволяющего различить два произвольных разведения СК-антигена вируса краснухи.
5.2.3 Тестирование неизвестной сыворотки
Титрование сыворотки. 1. В стеклянных пробирках готовят четырехкратные разведения исследуемой, контрольной положительной и контрольной отрицательной сывороток, смешивая 0,1 мл каждой сыворотки с 0,3 мл VBS.
2. Для инактивации присутствующего в сыворотке комплемента пробирки инкубируют на водяной бане 30 мин при 56 °С.
3. 96-луночный планшет для микротитрования размечают, как указано на рис. 7.
4. В лунки 1—8 и 10 вносят по одному объему VBS. Количество заполненных рядов должно соответствовать числу тестируемых сывороток.
5. В лунки 1 и 10 добавляют по одному объему разведенной в четыре раза сыворотки.
6. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в первых восьми лунках. Таким образом получают последовательные двукратные разведения от 1:8 до 1: 1024. Из лунок 8 микротитратором удаляют по 0,025 мл.
7. В лунку с контролем антигена добавляют один объем VBS, а в лунку с контролем клеток — три объема VBS.
8. По одному объему КС-антигена вируса краснухи добав* ляют в каждую лунку, за исключением тех, где содержатся контроли сывороток, клеток и комплемента.
9. Один объем разведения, содержащего ЗЕК50, добавляют во все лунки, кроме лунок с контролем комплемента и контролем клеток.
10. Контроль комплемента готовят, как описано выше.
Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4°С.
12. Планшет выдерживают 30 мин при 37 °С, а затем в каждую лунку добавляют сенсибилизированные эритроциты, как описано выше.
13. Планшет инкубируют при 37 °С, как описано выше. Перед учетом результатов планшет выдерживают 90 мин при 4° для осаждения клеток.
Учет полученных результатов. На рис. 7 показан результат тестирования четырех неизвестных сывороток. Контроль комплемента подтверждает, что разведение комплемента действительно содержит ЗЕКбо Контроль клеток свидетельствует об отсутствии спонтанного лизиса сенсибилизированных эритроцитов. Полный лизис в лунках, содержащих контроли антигена и сывороток, свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антиген — антитело. Поэтому, если сыворотки содержат иммунные комплексы и инфицированы бактериями, результат реакции может быть искажен. Контроль с заведомо отрицательной сывороткой свидетельствует об отсутствии иммунных антител. Контроль заведомо положительной сыворотки показывает, что она содержит антитела в разведении 1: 128. В 256-кратном разведении антитела обнаружить не удалось. Таким образом, титр контрольной положительной сыворотки равен 128. Титры тестируемых сывороток от А до D составляют соответственно 8, 256, 16 и 64.
5.3 Радиальный гемолиз
Радиальный гемолиз — прекрасный метод для обнаружения IgG к вирусу краснухи, поскольку этим чувствительным и специфичным методом можно одновременно тестировать большое число сывороток.
IgG, специфичные к вирусу краснухи, обнаруживают по лизису эритроцитов, связанных с антигеном вируса краснухи и суспендированных в агарозном геле в присутствии комплемента.
Содержащиеся в сыворотке IgG к антигену вируса краснухи, связанному с эритроцитами, выявляют при одновременном тестировании контрольных гелей, содержащих комплемент и эритроциты, свободные от антигенов краснухи.
5.3.1 Приготовление гелей для радиального гемолиза
1. Расплавляют обычным образом два объема 1%-ной агарозы на буфере для постановки РСК и охлаждают до 43°С в водяной бане.
2. Эритроциты барана трижды промывают центрифугированием и ресуспендированием в том же буфере.
3. Трижды промытые клетки опять ресуспендируют в том же буфере, получая 15%-ную суспензию. В две пробирки, обозначенные «опыт» и «контроль», вносят по 0,3 мл полученной суспензии.
4. Растворяют ГА-антиген вируса краснухи и смешивают с 0,3 мл суспензии эритроцитов в пробирке, обозначенной «опыт».
5. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
6. Обе пробирки заполняют буфером для постановки РСК и центрифугируют для осаждения эритроцитов.
7. Супернатанты удаляют, а эритроциты ресуспендируют в 0,5 мл того же буфера с канамицином.
8. Растворяют лиофилизированный препарат комплемента. В опытную пробирку добавляют 0,5 мл неразведенного комплемента.
9. Пробирку выдерживают 10 с в водяной бане при 43 °С, затем ее содержимое смешивают с 15 мл расплавленной агарозой. Пробирку быстро закрывают пробкой и перемешивают содержимое для равномерного распределения эритроцитов, несколько раз переворачивая пробирку.
10. Сразу же после перемешивания смесь агарозы с эритроцитами выливают в горизонтально установленную квадратную пластиковую чашку Петри. Чашку обозначают «опыт».
Осторожным покачиванием равномерно распределяют агарозу по чашке Петри.
12. Для контрольной суспензии повторяют этапы 7—9. На соответствующей чашке делают надпись «контроль».
13. Чашки оставляют на 20 мин для затвердения агарозы. Результат учитывают сразу же, либо сохраняют чашки в течение четырех дней при 4°С.
5.3.2 Тестирование сывороток
1. Тестируемые сыворотки прогревают 20 мин на водяной бане для инактивации комплемента.
2. В залитых гелях «опыта» и «контроля» по матрице с помощью узкой стальной трубки, присоединенной к водоструйному насосу, проделывают лунки диаметром 3 мм.
3. Соответствующие лунки опытного и контрольного гелей заполняют сыворотками. В каждую постановку следует включить как заведомо отрицательную, так и слабо положительную сыворотку.
4. Гели помещают на ночь во влажную камеру при 37 °С.
5.3.3 Интерпретация полученных результатов
На пластинах с гелем против темного фона выявляют зоны гемолиза вокруг лунок. Сыворотки, вызывающие образование больших по сравнению с контролем зон гемолиза, содержат специфические антитела к вирусу краснухи. Сыворотки, не вызывающие гемолиза вообще или вызывающие образование зон гемолиза такого же диаметра, как и контрольных, не содержат специфических антител. Донор такой сыворотки восприимчив к первичной инфекции.
5.4 Обнаружение специфических IgMк вирусу краснухи методом «захвата» антител
Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет важное значение при постановке диагноза первичной и врожденной инфекций. Существует множество методов определения и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти методы заменены чисто иммунологическими методами, которые не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два основных варианта этих методов. Первый предполагает идентификацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса краснухи связывают с поверхностью пластика, инкубируют его с сывороткой пациентов, а затем с меченными антителами против IgM человека, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после каждой стадии проводить тщательную отмывку, то оставшаяся метка укажет на присутствие специфических IgM.
Альтернативным методом является метод «захвата» антител, при котором твердую фазу вначале связывают с антителами к IgM человека. Промывают и инкубируют с тестируемой сывороткой, что приводит к «захвату» содержащихся в ней IgM. Последующая инкубация с антигеном краснухи позволяет отобрать все специфические IgM. После очередной промывки связавшийся с твердой фазой антиген вируса краснухи выявляют в реакции с меченными антителами к вирусу краснухи.
Последние антитела — антитела-детекторы — могут быть помечены радиоактивным 1251 или связаны с ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Ниже мы опишем метод, основанный на использовании радиоактивных изотопов, поскольку он хорошо разработан и применяется в большинстве лабораторий. В качестве меченых антител в настоящее время широко используют мышиные моноклональные антитела, однако, к сожалению, они не всегда доступны. При необходимости мы советуем связаться с местной вирусологической лабораторией, которая смогла бы обеспечить вас моноспецифической сывороткой высокого титра. В противном случае сыворотка может быть получена стандартными методами или с помощью гибридомной технологии. Полученные антитела легко пометить иодом, как описано ранее {6]. Однако в последнее время все более популярным становится иммуноферментный метод. В частности, фирмой Rubenz-M производится коммерческий набор реагентов для метода «захвата» IgM, специфичных к вирусу краснухи. Кроме того, можно отдельно заказать моноклональные антитела к вирусу краснухи, конъюгированные с ферментом.