Методы клинической вирусологии (стр. 5 из 5)
5.4.1 Подготовка полистироловых гранул
1. В контейнер помещают полистироловые гранулы, которые заливают кроличьей антисывороткой к, разведенной в 500 раз в 1 н. НС1.
2. Гранулы встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед употреблением гранулы должны быть выдержаны на холоду не менее 48 ч.
3. Для мелкомасштабных экспериментов гранулы разливают по 12-мм пробиркам из полистирола. Гранулы промывают в специальном сосуде, удаляя жидкость пастеровской пипеткой, присоединенной с помощью вакуумного шланга к водоструйному насосу. Описанные выше процедуры могут быть значительно упрощены при использовании специальных систем фирмы AbbottDiagnosticsLtd.
5.4.2 Тестирование
1. Отбирают требуемое количество гранул, отсасывают НС1 и покрывают гранулы PBSA с 1% БСА. Суспензию инкубируют 3 ч при комнатной температуре.
2. В лунки или пробирки, используемые для тестирования, разливают по 200 мкл PBSA с 0,05% твин 20, затем в них добавляют по 5 мкл исследуемых и контрольных сывороток. Смешанный препарат сывороток от 4—8 недавно выздоровевших больных принимают за 100 условных единиц IgM, специфичных к вирусу краснухи. Положительные контроли, содержащие 40, 10, 3,3 и 1 условных единиц, получают, разводя смешанную сыворотку заведомо отрицательной человеческой сывороткой. Они используются в каждом тестировании для построения стандартной калибровочной кривой. Кроме того, в каждый опыт необходимо включать отрицательный контроль.
3. В каждую лунку или пробирку с приготовленным 40-кратным разведением тестируемых и контрольных сывороток добавляют гранулы, покрытые сывороткой кролика против ц-цепей IgM человека. Образцы инкубируют 3 ч при 37 °С.
4. Гранулы трижды промывают PBST, а затем инкубируют с 200 мкл ГА-антигена вируса краснухи, разведенного в 10 раз в PBST. Образцы инкубируют 18—24 ч при 4°С. После инкубации гранулы трижды промывают в PBST.
5. В каждый образец добавляют по 200 мкл антител-детекторов, меченных 1251 и разведенных до 50 000 имп/мин на 200 мкл. Для разведения используют PBS с 2% твин 20, 20% кроличьей сыворотки и 10% заведомо отрицательной человеческой сыворотки.
6. Гранулы промывают четыре раза PBST и определяют радиоактивность с помощью счетчика. Далее усредняют результаты параллелей, вычитают счет фона и строят калибровочную кривую. Данные по контрольным сывороткам наносят на логарифмическую бумагу. Количество относительных единиц в исследуемых сыворотках определяют, сравнивая построенную калибровочную кривую со стандартной калибровочной кривой.
5.4.3 Интерпретация полученных результатов
Сыворотка, содержащая 3,3 условной единицы и более 3,3, считается положительной. Данный результат свидетельствует о недавно перенесенной или врожденной инфекции. Сыворотка, содержащая менее 1 условной единицы, считается отрицательной. Сыворотка, содержащая от 1 до 3,3 условной единицы, не может считаться ни положительной, ни отрицательной. В этом случае диагноз ставится с учетом клинической картины заболевания. Как правило, такие сыворотки все же рассматриваются как отрицательные. Тем не менее, они могут свидетельствовать об инфекции, перенесенной ранее.