Блокатор М1-ацетилхолінових рецепторів пірензепін інгібує пероксидацію ліпідів та стимулює активність глутатіонпероксидази, а також, цей же блокатор дозозалежно інгібує активність Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз.
Блокатор протонної помпи омепразол у концентраціях до 10-4 М стимулює активність глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази, а у вищих концентраціях інгібує їх. Омепразол також, подібно до фамотидину та пірензепіну, дозозалежно інгібує активність Са2+, Мg2+ - та Nа+, К+-АТФаз.
Практичне значення одержаних результатів. Зміна активності іон-транспортувальних систем і ферментів антиоксидантної системи при дії різних блокаторів може супроводжуватись модуляцією синтезу лімфоцитами біологічно активних речовин і здатністю клітин до хемотаксису. Оскільки Н2-гістамінові та М1-ацетилхолінові рецептори широко експресуються не тільки у клітинах СОШ чи ацинарних клітинах підшлункової залози, але й у лімфоцитах периферичної крові, ці клітини можуть бути зручною моделлю для вивчення механізмів дії блокаторів вказаних рецепторів, які використовуються для лікування кислотозалежних захворювань і панкреатитів. Отримані дані можуть слугувати основою для розробки методів корекції патологічних змін клітинного гомеостазу. З огляду на це можна ставити питання про створення та підбір нових фармакологічних препаратів, які модулюють активність глутатіонової антиоксидантної системи і транспортувальних АТФаз.
Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес кафедр медичної біології та генетики, нормальної фізіології і біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно проаналізувала наукову літературу за темою дослідження, сформулювала та обґрунтувала основні положення дисертаційної роботи і налагодила методи досліджень. Експериментальні дослідження, результати яких викладені у дисертації, здобувач проводила особисто. Постановка завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником і співавторами статей.
Апробація результатів дисертації. Апробація дисертації проведена на спільному засіданні кафедр нормальної фізіології і медичної біології та генетики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького 20 вересня 2007 року, протокол № 3. Основні положення дисертаційної роботи викладені у доповідях та обговорені на 63-й науковій конференції студентів і молодих вчених Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (Львів, 2003), Міжнародних наукових конференціях „Нейрогуморальні та клітинні регуляторні механізми процесів травлення” (Львів, 2003, 2007), Міжнародній науковій конференції „Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), Установчому з’їзді товариства клітинної біології (Львів, 2004), ІV Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, 2006); ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), Міжнародній науковій конференції „Механізми функціонування фізіологічних систем” (Львів, 2006).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 13 наукових працях: 7 статей (5 у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 – у зарубіжних часописах), 6 робіт у матеріалах конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 131 сторінках, побудована за традиційною схемою та складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 4-х розділів, де викладено отримані результати, проведено їх аналіз та узагальнення, а також із висновків і списку використаної літератури. Робота містить 25 рисунків і 4 таблиці. Бібліографічний список налічує 232 джерела.
Матеріали та методи дослідження. Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини виділяли з гепаринізованої свіжоотриманої крові практично здорових донорів віком 21-28 років у градієнті концентрації фікол-урографіну (480 зразків) (A. Boum, 1968). Підраховували клітини у камері Горяєва, використовуючи як барвник 0,1% трипановий синій. Життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах складала не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім.
Для розкриття глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної та Nа+, К+-АТФазної латентної активностей до суспензії лімфоцитів додавали 0,2% сапонін, а для визначення глутатіонпероксидазної та Са2+, Мg2+-АТФазної активностей - 0,1% сапонін. Дана методика грунтується на роботах, виконаних на еритроцитах, лімфоцитах і сперматозоїдах (Орлов С.Н. и др., 1985; Підковка Н.О., 2003; Maksymjuk H. V., Vorobets Z. D., 2000).
Інтенсивність пероксидної оксидації ліпідів (ПОЛ) оцінювали за вмістом одного із кінцевих метаболітів – малонового діальдегіду (Тимирбулатов С.А., Селезнев Е.И., 1988).
Глутатіонпероксидазну активність визначали за зменшенням вмісту GSH (Моин В.М., 1986), глутатіонредуктазну активність – за зменшенням вмісту NADPH (Mannervik V., 1991), глутатіонтрансферазну активність – за зменшенням вмісту GSH (Власова С. Н и др., 1990; Булавин Д.В., 1996).
Визначення Ca2+,Mg2+-АТФазної активності проводили при 37° С у середовищі, що містило 5 мМ Nа2АТФ, 5 мМ МgС12, 5 мкМ СаС12, 0,02 М трис-НCl буфер (рН=7,4). До інкубаційного середовища додавали лімфоцитарну суміш. Реакцію зупиняли додаванням 1 мл 20% ТХО. Зразки 10 хв центрифугували при 800 g. У супернатанті визначали вміст неорганічного фосфату за методом Фіске-Субароу (Меншиков В.В., 1987). Активність Са2+, Мg2+-АТФази оцінювали за величиною, що інгібувалась 1 мМ розчином ЕГТА, та відображали у мкмолях Фн (хв · мг білка) - 1. Мg2+-АТФазну активність визначали у тих же умовах, але за відсутності СаС12 із додаванням 1 мМ ЕГТА та 0,1 мМ оуабаїну (Орлов С.Н., 1977). За Na+,K+-ATФазну активність приймали таку, що інгібувалась 0,1 мМ розчином оуабаїну.
Препарати фамотидину, пірензепіну, омепразолу використовували в концентраціях 10-6...10-3 М.
Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel 2003.
Функціональні властивості глутатіонзалежних ферментів і транспортувальних АТФаз лімфоцитів крові при пермеабілізації клітин сапоніном. Відомо, що очищені ферменти глутатіонової антиоксидантної системи не є Ca2+-залежними (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Doroshow J. H., 1995; Mannervik B., 1991). Однак, невідомо, як вони функціонують in vivo. Значна кількість даних вказує на те, що на активність цих ферментів, якщо не прямо, то опосередковано, впливає іонізований кальцій (Підковка Н.О., Воробець З.Д., 2002).
Враховуючи те, що ряд ферментів, які ми вивчали, локалізовані з внутрішнього боку плазматичної мембрани (АТФази, глутатіонпероксидаза - ГП, глутатіонтрансфераза - ГТ), інші - у цитозольній фракції (глутатіонредуктаза - ГР), для розкриття їх латентної активності доцільною є пермеабілізація клітинних мембран.
Згідно завдань досліджень, був проведений підбір оптимальних умов для визначення ГР-, ГП - та ГТ-ої активностей лімфоцитів периферичної крові, з використанням як пермеабілізуючого агента сапоніну. Для цього в інкубаційне середовище для визначення ферментативної активності додавали сапонін у діапазоні концентрацій 0,02...0,3%. ГП-а активність практично не змінювалась при низьких концентраціях сапоніну (до 0,04%), вона становила 9,2±0,9 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1. Цей показник значно зростав, до 75,0±6,8 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1 (р < 0,05), при вмісті сапоніну 0,1%. За наявності в інкубаційному середовищі вищих концентрацій (0,2%) цієї сполуки ГП-а активність різко знижувалась.
Встановлено, що ГР-а активність лінійно зростає від 4,2±0,3 нмоль NADРН (хв · мг білка) - 1, за відсутності сапоніну, до 30,0±3,1 нмоль NADРН (хв · мг білка) - 1, із підвищенням концентрації сапоніну до 0,2%.
У діапазоні концентрацій сапоніну 0...0,04% спостерігались дуже низькі значення ГТ-ої активності. При 0,04% вмісті сапоніну в інкубаційному середовищі ферментативна активність становила 3,2±0,3 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1. За більших концентрацій (0,1-0,2%) сапоніну було виявлено лінійне зростання ГТ-ої активності до 68,1±6,7 нмоль GSН (хв · мг білка) - 1 (р < 0,05).
Таким чином, отримані результати довели необхідність підбору оптимальних концентрацій сапоніну для визначення активності глутатіонових антипероксидних ферментів нативних лімфоцитів периферичної крові.
При визначенні Са2+, Мg2+-АТФазної активності у діапазоні концентрацій сапоніну 0,02...0,1% спостерігалось зростання показника до 7,9±1,3 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1. Більші концентрації сапоніну пригнічували активність даного ферменту.
Виявлено, що Na+, К+-АТФазна активність зростає лінійно відповідно до підвищення концентрації сапоніну в інкубаційному середовищі. Максимальна активність даного ферменту становила 10,6±0,6 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1, за 0,2% концентрації сапоніну.
Отже, низькі концентрації сапоніну (0,02...0,04%) є недостатніми для розкриття латентної активності досліджуваних ферментів. Оскільки це є здебільшого мембранозв’язані або цитозольні ферменти, а ГР - виключно цитозольний, для їх активації необхідна більша концентрація сапоніну - 0,1% для ГП, Са2+, Мg2+-АТФази та 0,2% для ГР, ГТ, Na+, К+-АТФази.
Оскільки функціонування будь-яких ферментів залежить від багатьох факторів, завданням наступного етапу роботи був добір оптимальних значень таких показників, як рН, концентрація білка, АТФ, співвідношення катіонів Na+ і К+, час інкубації для визначення Са2+, Мg2+-АТФазної та Na+, К+-АТФазної активностей лімфоцитів крові.
Було показано, що оптимум рН для Са2+, Мg2+-АТФази становить 7,0. За цих умов спостерігалась максимальна активність ферменту - 16±1,4 мколь Фн (хв · мг білка) - 1. Na+, К+-АТФазна активність сягала максимального значення при рН 6,8 і становила 10±0,7 мкмоль Фн (хв · мг білка) - 1. Зниження рН інкубаційного середовища від 7,4 до 6,0 призводило до істотного посилення інгібувального впливу Са2+ на АТФ-гідролазну активність ферменту. Зміщення рН у лужний бік, зокрема до 8,0, зменшувало інгібувальний ефект катіонів кальцію на активність Na+, К+-АТФази.