Реферат на тему:
«Микробиологическая диагностика и прогноз брюшного тифа»
Микробиологическая диагностика
Микробиологическая диагностика брюшного тифа основывается на выделении возбудителя из организма и обнаружении специфических антител. Для выделения возбудителя в начальном периоде болезни исследуются кровь и в некоторых случаях дуоденальное содержимое, костный мозг, содержимое розеол и др. материалы; в поздние сроки, кроме того,— испражнения, моча, спинномозговая жидкость, гной. В случае смерти исследуется секционный материал. Посев мокроты, пота, гноя, спинномозговой, плевральной и др. жидкостей применяется для выяснения природы осложнений.
Посев крови. Результаты исследования крови зависят от периода и тяжести болезни, количества взятой крови, качества питательной среды. Наиболее часто (до 100%) гемокультура брюшного тифа выделяется на 1-й неделе болезни, на 2—3-й неделе процент положительных находок снижается. Для повышения эффективности исследования некоторые авторы рекомендуют за 15 мин. до взятия крона «водить подкожно 1 мл адреналина в разведении 1:1000, под влиянием его, по мнению ряда авторов, возбудитель, находящийся в селезенке, поступает в кровь. Кровь для посева в течение первой недели болезни с соблюдением стерильности берется из локтевой вены в количестве не менее 10 мл. В более поздние сроки и во время рецидивов целесообразен посев крови в количестве 15—20 мл. У детей кровь в небольшом количестве берут из пятки, пальца, мочки уха. Кровь засевается в жидкую питательную среду в соотношении не менее чем 1: 10.
Из жидких питательных сред применяются: Рамотортл среда по 100, 150, 200 мл во флаконе: 10% желчный бульон по 100, 150, 200 мл во флаконе; бычья желчь по 5—10 мл в пробирке; мясопептонный бульон с 1% глюкозы во флаконах по 100, 150, 200 мл; стерильная дистиллированная или водопроводная вода в тех же объемах. Питательным субстратом в последнем случае служат продукты распада форменных элементов крови. Наилучшие результаты получаются при использовании первых двух сред. При невозможности посеять кровь у постели больного для предупреждения свертывания 10 млкрови выливают в пробирку с 2 л.« 5% стерильного раствора лимоннокислого натрия. В лаборатории нитратная кровь засевается в одну из вышеуказанных сред. Для уменьшения бактерицидных свойств крови при невозможности провести посев на месте некоторые авторы рекомендуют производить посев кровяного сгустка. Кровь из шприца выливается в стерильную пробирку. Образовавшийся сгусток после удаления стерильной пипеткой сыворотки размельчают стерильной стеклянной палочкой и засевают на одну из перечисленных сред. Посев крови помещается в термостат при 37° на 18—24 часа. В положительных случаях через этот срок (иногда позже) на средах с желчью отмечается помутнение среды или небольшой придонный осадок; среда Рапопорта при росте брюшнотифозных палочек мутнеет и краснеет (образование кислоты вследствие разложения глюкозы или маннита). Из флакона производят высев на чашку с твердой дифференциальной средой с лактозой (Эндо, Левина и др.). Высев на среду Плоскирева (бактоагар Ж) проводить не рекомендуется, поскольку из-за резкой смены условий питания брюшнотифозная палочка не растет или растет очень плохо. Одновременно готовят и изучают мазки, окрашенные по Граму, подвижность в висячей или раздавленной капле. В случаях роста чистой культуры производят посев на косой агар и среды Гисса. Все посевы ставят в термостат при 1°37° до следующего дня. При обнаружении чистой культуры подвижных, грамотрицательных палочек, покраснения среды Рапопорта без газообразования дается предварительное положительное заключение о выделении возбудителя брюшного тифа.
На второй день исследования изучают колонии на дифференциальной среде и прозрачные, бесцветные или цвета среды колонии пересевают на «короткий пестрый ряд» (жидкие или полужидкие среды с лактозой, глюкозой и косой агар) или на Ресселя средудля дальнейшего изучения. Использование полужидких сред Гисса позволяет определить подвижность микробов (на лактозе), не прибегая к высеву на среду Пешкова. Полученную на косом агаре чистую культуру исследуют в окрашенных по Граму мазках и определяют подвижность микроба. По обнаружении грамотрицательных, подвижных палочек производят посев: на «длинный пестрый ряд» (среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, мальтозой, сахарозой); на косой агар, на мясопептонный бульон с вложенными под пробку полосками фильтровальной бумаги, смоченными насыщенным раствором уксусно-кислого свинца (для определения сероводорода) и 12% раствором щавелевой кислоты (для определения индола). Одновременно на предметном стекле ставят ориентировочную реакцию агглютинации и при положительном результате для определения титра развернутую агглютинацию с соответствующими специфическими сыворотками.
Если после первого высева на дифференциальной среде рост отсутствует, то последующие высевы производят ежедневно в течение 7 суток. При отсутствии роста на 8 сутки дается отрицательный ответ. При слабо выраженной бактериемии рост возбудителя в ряде случаев обнаруживается на 2— 3 неделе выдерживания посевов в термостате. В сомнительных случаях поэтому рекомендуется делать высевы до 24-го дня с момента взятия материала, независимо от получения отрицательного результата на 8-е сутки исследования.
На третий день исследования регистрируется результат посева на «короткий пестрый ряд» или среду Ресселя, изучается морфология и чистота выделенных культур путем приготовления мазков и окраски их по Граму, определяется подвижность. Отобранные культуры пересевают на «длинный пестрый ряд», ставят ориентировочную, затем развернутую реакцию агглютинации. Регистрируют результаты посева культуры с косого агара на «длинном пестром ряду», учитывают титр реакции агглютинации и на основании совокупности полученных данных делают окончательное заключение. В случае инагглютинабильности выделенного штамма ставят реакцию агглютинации на стекле с Усывороткой, поскольку культуры, выделенные из организма больного, могут быть в у-форме. При отсутствии агглютинабпльностп с 1-сывороткой проводят 3—4 ежедневных пассажа на желчном 10% бульоне. При невозможности произвести реакцию агглютинации с У-сывороткой реакция агглютинации ставится с гретой (прогревание при 60° в течение 30 мин.) или кипяченой (кипятится при 100° 5 мин.) взвесью изучаемого штамма.
При наличии нечетких результатов относительно биохимической активности или агглютинабильности выделенной культуры окончательный ответ не выдается, а на четвертые сутки продолжают изучение чистых культур, полученных из колоний с дифференциальной среды.
Выделенная культура может быть типирована специфическими У1-фагами. При этом она должна быть в у-форме (содержать У1-антиген). Чистая у-форма агглютинируется У-сывороткой и не агглютинируется О-сывороткой; у\у-форма агглютинируется той и другой сывороткой; \»-форма агглютинируется только О-сывороткой. Культура, находящаяся в у\у-форме, для освобождения от \у-форм рассевается на чашку Петри, и затем отбираются колонии, не агглютинирующиеся О-сывороткой. От теформ можно также освободиться с помощью О-сыворотки или сыворотки Гертнеа. В центрифужную пробирку наливают млбульона и в нем разводят О-сыворотку 1: 20—1: 50. В разведенную сыворотку вносят петлю суточной агаровой культуры. Пробирки помещают в термостат на 10 мин. и затем центрифугируют при 3—5 тысячах оборотов в течение 10 мин. Пробирки снова помещают в термостат на 30 минут и центрифугируют 10 минут. Верхний слой жидкости рассевают на чашки с агаром.
После 18—20-часовой инкубации при 37° выделяют колонии под контролем О-сывороток.
Типированию подвергается 3—4-часовая бульонная культура. Она наносится на чашку с 1,1% прозрачным агаром платиновой петлей или пастеровской пипеткой в виде секторов по числу имеющихся типов фага. После этого чашка подсушивается в термостате в течение 30 мин. На высохшие капли микробной взвеси наносятся платиновой петлей одинаковые объемы типовых фагов в критическом тест-разведении (указывается на этикетке ампулы). Чашки помещают в термостат и на следующий день оценивается результат. Некоторые типы культур могут давать групповую реакцию с другими типами фагов. Около 15% культур из числа содержащих У1-антиген не типируются.
Для сокращения сроков исследования Московский институт вакцин и сывороток им. Мечникова и некоторые другие институты используют строго специфические и монорецепторные сыворотки. Посев и исследование на 2-е сутки при этом проводится, как описано выше. На 3-й день изучаются мазки, окрашенные по Грану, и в зависимости от биохимической активности на лактозе и глюкозе ставится реакция агглютинации на стекле с О- и потом Н-сыворотками. Н-сыворотка выбирается в зависимости от групповой принадлежности штамма (А, В, С, Б). По совокупности данных на 3-й день дается окончательный ответ. При наличии нечетных результатов культуры исследуются, как указано выше.
Для посева крови по методу Блинкина в плоских флаконах емкостью в 200 мл на одной стенке скашивается агар с 1% глюкозы и индикатором Андреде, на второй — с 1% лактозы с этим же индикатором. РЬ среды при заготовке устанавливается=7,6. Во флаконы вносят 50 мл 50% желчного бульона или 50% желчную воду и в эту среду засевают не менее 10 мл крови. Посев помещают в термостат при 37° на 12 часов. Потом, наклоняя флакон в одну, а затем в другую сторону, смачивают поверхности агара с глюкозой и лактозой. Результат посева рассматривается через сутки. При отсутствии роста смачивание агаровых пластинок повторяют, и посев повторно рассматривается через 12 часов.
Для суждения о степени бактериемии кровь в количестве от 0,5 до 2 мл смешивают с 8 мл растопленного и охлажденного до 45° питательного агара, и смесь выливают в стерильную чашку Петри. Через 24—48 часов подсчитывают выросшие колонии. С этой же целью определяется индекс бактериемии по методу Рапопорта. Кровь засевают в 20 пробирок с жидкой средой (бульон с глюкозой и кислым фуксином) в количествах от 0,1 до 2 мл. В зависимости от тяжести и времени, прошедшего от момента заболевания, рост может наблюдаться во всех пробирках (тяжелые случаи) или в части пробирок, засеянных большими объемами крови (случаи средней тяжести), или отсутствует (легкие случаи).