У нас в стране инициаторами данного интересного направления явились сотрудники лаборатории, руководимой Ю.А. Чизмаджевым в Институте электрохимии АН СССР. Этому способствовали, во-первых, проводимые в лаборатории теоретические и экспериментальные исследования по механизмам электропробоя искусственных и естественных мембран, явления, несомненно, лежащего в основе процесса электрослияния; во-вторых, теоретические и экспериментальные разработки непосредственно по проблеме электрослияния мембран. Соответствующие публикации и тесные научные контакты сотрудников Института электрохимии с биологическими институтами способствовали использованию метода электростимулируемого слияния клеток для их реконструкции в других лабораториях страны
В упомянутом обзоре рассмотрены работы, в которых показано, что слияние клеток с помощью электрического стимула - явление довольно универсальное. Так, было показано, что при наложении импульсов электрического поля длительностью в 40 мкс и амплитудой 4-6 кВ/см на суспензию микроорганизмов Dictyosteliumdiscoideum приводит к их слиянию и появлению значительного количества многоядерных клеток (до 40 ядер). Важно подчеркнуть, что эти клетки не удается сливать двумя широко распространенными для слияния методами: полиэтиленгликолем и вирусом Синдай. В других работах было показано, что аналогичный прием по электростимуляции суспензии клеток приводит к увеличению частоты слияния протопластов дрожжей. При этом отмечается, что слившиеся клетки способны к делению.
В описанных работах, а также многих других проводили слияние клеток в суспензии. В данном случае предварительно перед сильным импульсом тока, вызывающим слияние, необходимо каким-либо способом вызвать агрегацию клеток, чтобы клетки контактировали друг с другом. Для этих целей широко используется метод диэлектрофореза, при котором клетки в случае достаточно высокой их концентрации в растворе, плотно контактируют друг с другом и создают цепочки клеток вдоль силовых линий неоднородного высокочастотного электрического поля. Интересны различные модификации указанного подхода. Так, при слиянии клеток миеломы и лимфоцитов мышей вначале с помощью диэлектрофореза формировали монослой клеток миеломы с помощью специальной формы платинового электрода, а затем в ячейку вводили лимфоциты. При этом установлено, что возникающие после электрослияния клетки-гибриды хорошо растут.
Для получения соматических гибридов при электростимуляции были использованы и другие приемы: создание плотной суспензии с помощью центрифугирования, стимулирование адгезии с помощью различных химических агентов, культивирование клеток в монослое, где естественным образом формируются межклеточные контакты, на электропроводящей подложке.
В некоторых работах было специально проведено сравнение эффективности электрослияния фибробластоподобных клеток при различных способах достижения мембранного контакта:
1) посредством диэлектрофореза клеток в переменном электрическом поле,
2) с помощью центрифугирования и образования плотного клеточного осадка,
3) путем выращивания клеток на проводящей подложке и формирования двойного клеточного слоя. Показано, что наиболее эффективным оказался третий способ (индекс слияния 50-70%) и практически неэффективным - первый. Авторы объясняют это возникновением в условиях естественного формирования двойного клеточного слоя (по данным электронной микроскопии) обширных межклеточных контактов, что повышает вероятность слияния при воздействии поля. Однако использование этого способа возможно только для клеток, способных к росту и формированию контактов, поэтому авторы предполагают, что наиболее универсальным может оказаться второй способ получения мембранных контактов.
Другой важный вопрос состоит в подборе оптимальной межклеточной среды, в которой проводится электрообработка клеток. Так, имеются указания, что присутствие в среде одновалентных ионов в концентрации выше 20 мМ значительно понижает эффективность электрослияния. Однако в одной из работ убедительно показано, что ионная сила раствора не влияет на величину нарушения барьерных свойств мембраны при электрическом пробое, а, по-видимому, изменяет характер контактов между мембранами. В случае наличия хороших контактов между фибробластами, когда они растут на плоской подложке, наблюдается высокий индекс электрослияний при концентрациях Nad или КCl, достигающих 140 мМ.
В работах Сухарева, Бандриной, Барбула отмечается, что электрообработка клеток в среде, содержащей 1-2 мМ Са 24 ", приводит практически к 100% -ной гибели клеток. По-видимому, в этих условиях необратимо нарушается ионный гомеостаз за счет значительного входа ионов кальция в цитоплазму. А при обработке клеток в среде с низким содержанием кальция (10 мкМ) выживаемость клеток резко возрастает (до 40%). Ситуация улучшается еще больше, если после электрообработки клетки помещаются в среду, богатую ионами натрия. В этих работах также указывается, что важным положительным компонентом среды электрообработки является сахароза (100-150 мМ), а также диализованная против бескальциевого буфера сыворотка (в количестве l/s по объему). Это позволяет получить максимальный выход поликарионов, которые жизнеспособны в течение нескольких дней.
В ряде исследований указывается, что цитоскелет, вероятно, не принимает непосредственного участия в процессе слияния клеток после их электрообработки и слияния цитоплазм, характерное время которого для L-клеток ~90-120 мин, так как ни цитохалазин В и Д, николцемид практически не влияют на скорость и конечный индекс слияния. Также указывается, что разбавление среды после электрообработки дистиллированной водой на Уз ускоряет процесс объединения цитоплазм клеток. Предполагается, что это связано с изменением натяжения поверхностной мембраны.
Итак, в настоящее время уже достаточно широко ведутся исследования по поиску оптимальных условий для электрослияния животных клеток.
Метод электростимулируемого слияния клеток начинает широко использоваться и для растительных клеток. Для растительных протопластов Petuniainflata установлено, что полученные электростимулируемым слиянием гибридные клетки способны образовывать клеточные стенки и делиться. Описано электрослияние протопластов из листьев диплоидного вида картофеля с суспензионными протопластами махорки. Разная способность к слиянию протопластов из листьев и суспензии позволила подобрать условия для получения 40-50% гетерологических слияний, 60-70% из которых составляли бинарные (1:
1). Отмечается, что важная модификация метода электрослияния растительных клеток состоит в возможности предварительного отбора пары протопластов, предназначенных для слияния. Это позволяет по-новому подойти к решению трудной проблемы отбора гибридных продуктов при массовом слиянии протопластов. Несомненное преимущество электрослияния - контролируемость процесса, увеличение числа попарно слившихся и, более того, специально выбранных для этого протопластов, привлекает к указанному методу все большее число исследователей.
Таким образом, на разнообразных типах животных и растительных клеток показана эффективность использования для их реконструкции метода электростимулируемого слияния клеток. Не случайно метод получает быстрое распространение в различных лабораториях.
Необходимо отметить, что, как правило, в работах, где используют либо суспензии клеток, либо монослойную культуру, применяют способ множественного слияния клеток. Площадь электродов в этом случае всегда во много раз превышает размеры единичной клетки. Вместе с тем при реконструкции клеток в связи с переносом генетического материала оказалось целесообразным использовать метод локального электрослияния, когда два электрода непосредственно подводят к паре клеток, которые предполагается сливать. Такие приемы, например, были использованы при слиянии бластомеров ранних эмбрионов млекопитающих с формированием полиплоидных клеток.
Интересные результаты по применению метода электростимулируемого слияния клеток были получены в последнее время на эмбриональных клетках млекопитающих.
Проблема пересадки ядер зиготы или реконструкция клетки - одна из центральных в биологии, так как позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биологии развития. Успехи, в этой области, достигнутые на зародышах амфибий, рыб и беспозвоночных, вселяли, в частности, уверенность в принципиальную возможность клонирования организмов. Особый интерес представляют подобные исследования на зародышах млекопитающих. Однако опыты по пересадке ядер у зародышей млекопитающих технически существенно сложнее, чем у зародышей рыб и амфибий.
Яйцеклетки млекопитающих значительно более чувствительны к микрохирургическим манипуляциям, связанным с удалением и введением в них ядер. Инъекционный способ введения кариопластов приводит, как правило, клетку к гибели. Подобные особенности зигот млекопитающих вероятнее всего, связаны с тем, что их объемные размеры в несколько тысяч раз меньше, чем объемные размеры зигот амфибий и рыб. В соответствии с этим при проколе поверхностной мембраны микроинструментом для удаления и введения ядер зиготы млекопитающих испытывают несравненно большее повреждение, чем зиготы рыб и амфибий. Такое повреждение поверхностной мембраны практически всегда приводит к гибели клетки млекопитающих в связи с необратимым нарушением гомеостаза.
Была предложена методика, которая не требовала пенетрации микропипеткой цитоплазматической мембраны клетки. Введение ядра донора в энуклеированную зиготу достигалось с помощью вируса Сендай.