Эксперименты были проведены на мышах CBWA альбиносах-тетрагибридах. В качестве приемных самок использовали гибриды Fi (СВАХ ХС57) (aqouti). Мышей получали из питомника "Светлые горы". Одноклеточные зародыши на стадии пронуклеусов, практически лишенные кумулюса, получали от мышей CBWA первого дня беременности. Для вымывания и культивирования зигот использовали модифизированную среду Виттена. Для микрохирургии эту среду разбавляли на 20% дистиллированной водой с целью поддержания тургора клеток. Кроме того, в среду для операций добавляли цитохалазин В в дозе 5мкг/мл. В специальную микрокамеру типа Фонбрюна помещали 10-15 зигот в среду для микрохирургии. Время инкубации зигот в среде до операции не превышало 15 мин. Все манипуляции проводили при комнатной температуре.
При проведении микрохирургической операции выяснилось, что после прокола зоны пеллюцида микроинструмент внедряется в глубь клетки, не повреждая поверхностную мембрану клетки. Это определяется главным образом действием цитохалазина В. Клетка сохраняет жизнеспособность до тех пор, пока не нарушена целостность цитоплазматической мембраны. Кариопласт формируется за счет всасывания пронуклеусов вместе с цитоплазмой и наружной поверхностной мембраной в микропипетку. Происходит как бы искусственное деление клетки. Попытки вернуть кариопласт обратно в зиготу не удаются. Мембрана кариопласта контактирует с зиготой и может так сохраняться в течение достаточно долгого времени (1-2 суток), но слияния не происходит. При этом энуклеированная зигота не делится, а кариопласт частично фрагментирует. Для реконструкции зиготы необходимо их истинное слияние. Для слияния такой клеточной пары были использованы электрические стимулы вместо вируса Сендай. Электрослияние было проведено в той же среде, в которой оперировали зиготы.
Предполагают, что слияние двух соседних клеток при подаче на них внешнего электрического поля происходит за счет необратимого электрического пробоя контактирующих мембран. Очевидно, что решение этой задачи связано с поисками таких способов приложения электрического поля, при которых максимум падения напряжения приходится на мембраны в области контакта. Было опробовано несколько вариантов с использованием внеклеточных электродов.
Импульс тока подавали в момент, когда кариопласт, вводимый под зону пеллюцида, приходил в контакт с энуклеированной зиготой. Во всем диапазоне использованных токов слияния не достигалось. При подаче импульсов тока внутри микроинструмента возникали достаточно сильные и направленные электрофоретические смещения среды, что приводило к разрушению кариопласта. Возможно, этому способствовал и локальный нагрев.
Микроэлектрод подводили в область контакта и пропускали импульсы тока. При этом наблюдали единичные случаи слияния кариопласта с энуклеированной зиготой, однако при удалении электрода, из области контакта либо кариопласт, либо зигота разрушались. Вероятно, за счет высокой плотности тока вблизи кончика микроэлектрода происходит локальный нагрев и прилипание микроэлектрода к поверхности кариопласта или зиготы.
В следующем варианте использовали большие электроды, когда сами электроды и расстояние между ними в несколько раз превышало размеры клетки. В большинстве случаев вскоре после слияния наблюдали гибель реконструированной зиготы. Очевидно, при таком способе необратимый пробой мембраны происходил не только в области контакта кариопласта с энуклеированной зиготой.
Наиболее удачным оказался последний вариант с электродами, у одного из которых диаметр торца был 70-100 мкм, у другого 20-30 мкм, что примерно соответствовало размерам энуклеированной зиготы и кариопласта. Существенно, что электроды были тщательно изолированы, за исключением торцов. Доля удачных электрослияний при этом составляла 75%, а с электродами без изоляции только 25%.
При проведении основной серии опытов с использованием последнего варианта прооперированную зиготу с введенным под зону пеллюцида кариопластом помещали вплотную между двумя электродами таким образом, чтобы плоскость контакта цитопласта и кариопласта была перпендикулярна прямой, соединяющей кончики электродов. Каждую клеточную пару отдельно подвергали действию электрических стимулов. Оптимальные параметры электростимуляции были следующими: напряжение на выходе стимулятора (ЭСЛ-2) 20 В, длительность импульсов 0,1 мс, расстояние между электродами 100-150 мкм.
Специальные измерения показали, что в используемой среде при подаче импульса 20 В длительностью 0,1 мс, при котором происходит слияние на межэлектродном расстоянии, примерно равном диаметру объекта (100 мкм). падение напряжения составляет 0,6 В. Эта величина возрастала до 1 В при введении между электродами объекта. Таким образом, на каждую из четырех мембран: двух в области контакта и двух, прилегающих к электродам, приходится в среднем по 0,25 В в начальный момент подачи импульса тока (до пробоя).
Можно предполагать, что возникновение пробоя в любой из указанных четырех мембран приведет к перераспределению потенциала, его возрастанию на остальных мембранах. Это будет способствовать возникновению пробоя в них. Таким образом, при электрослиянии пробой, вероятно, возникает во всех четырех мембранах, и только в области тесного контакта мембран он необратим.
Большинство клеток сливалось после одного импульса.
Можно отметить ряд моментов. Сразу же после электрического стимула наблюдается увеличение площади контакта между кариопластом и цитопластом, что является начальным этапом процесса слияния. Дальнейшее протекание процесса слияния характеризуется постепенным размыванием или растворением контактирующих между собой мембран. Время между электрическим стимулом и визуально наблюдаемыми признаками начала процесса слияния варьирует от 1-15 с до 20-30 мин, т.е. на три порядка. Основное количество клеток сливается в течение 1-10 мин. К неслившимся клеткам прилагали дополнительно серию импульсов (два-три импульса с интервалом в несколько секунд), что заметно увеличивало процент слияния.
Высокий процент электрослияиий, имеющий место в этих опытах (до 75%), наблюдается в присутствии цнтохалазина В в концентрации 5 мкг/мл. Вместе с тем в специальных опытах было показано, что при этих концентрациях цитохалазина В жесткость кортекса зигот понижается в десятки раз, что свидетельствует об очень сильной деполимеризации примембранных микрофиламентов. Это означает, что процесс электрослияния может эффективно осуществляться без участия указанных структур. Также было отмечено, что гипотония (разбавление используемой нами среды на 20-30% дистиллированной водой) облегчает процесс слияния. Возможно, это обусловлено не столько изменением натяжения мембраны, сколько тем обстоятельством, что начальные этапы слияния связаны с некоторым увеличением суммарного объема зиготы и кариопласта, а повышение клеточного тургора способствует указанному процессу. Высокий процент слияний осуществляется в среде с высокой ионной силой. По-видимому, формирование обширного адгезионного контакта не зависит от ионного состава среды, так как зона пеллюцида обеспечивает достаточно сильный механический прижим зиготы и кариопласта друг к другу.
Для проверки жизнеспособности 30 зигот мышей CBWA, реконструированных электрослиянием, были трансплантированы в яйцеводы приемным самкам Fi (СВАХ С57) по три-четыре клетки на приемную мышь. У трех из восьми самок родилось по одному детенышу, которые отличались по цвету шерсти от собственных мышат. По росту и поведению они не отличались в дальнейшем от собственного потомства реципиентов. Это позволяет сделать вывод, что электрослияние не вносит заметных нарушений в геном и может быть использовано в широком круге задач по клеточной инженерии.
При электростимулируемом слиянии клеток геном не повреждается. Факт полного и нормального эмбрионального развития от зиготы до взрослых особей - убедительный довод в пользу сохранности генома. В первом приближении эти данные, по-видимому, можно распространить и на другие клетки животного и растительного происхождения, реконструированные электрослиянием.
Важная особенность метода электрослияния - его универсальность. Действительно, если в основе механизма электрослияния лежит процесс пробоя липидного бислоя клеточной мембраны и образования пор, то тогда явлению электрослияния должны быть подвержены все клеточные мембраны без исключения. И действительно существуют типы клеток, которые невозможно слить с помощью полиэтиленгликоля или вируса Сендай, но которые сливаются при электростимуляции. Конечно, при этом важно помнить, что необходимым условием для электрослияния является возможность прямого контакта между мембранами клеток, которые предполагается сливать.
Существенный положительный момент метода электрослияния состоит в том, что он не связан с химическим воздействием. Действующим началом здесь является не какой-либо химический или биологический фактор, который необходимо вводить в раствор к исследуемому объекту, а электрический ток, пропускаемый через объект. В среду для электрослияния ничего дополнительного не вносится, кроме электродов, да и то на короткое время. При подаче необходимого для сливания электрического поля на клетки, как мы уже отмечали, по существу возможны два случая: либо обе клетки или одна из сливающихся клеток сразу же разрушается (в пределах 5-15 с), что означает образование у мембраны необратимого пробоя; либо слияние проходит благополучно, что означает обратимость пробоя. Во втором случае происходит, по-видимому, временное нарушение гомеостаза внутриклеточной среды за счет образования пор. Принципиально иная ситуация имеет место при действии на клетки полиэтиленгликоля или инактивированного вируса Сендай. В этом случае используемые факторы попадают внутрь клетки и могут там каким-либо образом достаточно долго и сложно взаимодействовать с внутриклеточными структурами. Не случайно есть указания, что и полиэтиленгликоль и вирус Сендай могут понижать жизнеспособность клеток.