Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій на основі дослідження протимікробних властивостей похідних тіазолідину, фурану, хіноліну, акридину і б (стр. 5 из 12)

Токсикологічні дослідження окремих препаратів включали вивчення їх цитотоксичності in vitro в культурі перитонеальних макрофагів мишей (Вильнер Л.М., 1977). Гостру токсичність сполук in vivo оцінювали при різноманітних шляхах введення за значеннями максимально переносимих (МПД) і летальних доз (LD10, LD50 і LD90), встановленими методом пробіт-аналізу (Біленький М.Л., 1963). Також вивчали ефект кумуляції (Гацура В.В., 1974) та подразнюючу дію препаратів (Ієвлєва Е.А., 1974).

Для статистичної обробки результатів мікробіологічних та імунологічних експериментів застосовано методи варіаційної статистики, одно - і двовибірковий F-тест для дисперсії, кореляційний, лінійний регресійний, одно - і двофакторний дисперсійний (ANOVA), багатофакторний об’єднуючий кластерний аналіз, пробіт-аналіз із використанням спеціалізованих комп’ютерних програм WHONET 5.1, UTHSCSA ImageTool 2.0, STATISTICA for Windows 5.0, MSOffice Excel 2003.

Результати власних досліджень викладені у наступних семи розділах дисертації (3-9).

Аналіз чутливості сучасних клінічних штамів стафілококів до антибіотиків та антисептиків. Створена система моніторингу за збудниками опортуністичних і внутрішньолікарняних інфекцій дозволила з’ясувати особливості епідеміології MRS і штамів з пограничною метіцилінрезистентністю у Прикарпатському регіоні в 1990-2006 рр. У загальній структурі ізолятів стафілококів, визнаних етіологічними чинниками опортуністичних і госпітальних інфекцій, частка MRSA становить 27,0%, MR-CNS – 22,7%, штамів з пограничною метіцилінрезистентністю – 20,6% (BSSA) і 24,4% (BS-CNS). В нестаціонарних умовах MRS виступають в ролі етіологічних факторів нагнійних і запальних процесів значно рідше (4,9-8,8%). За частотою виділення стафілококів з пограничною метіцилінрезистентністю (18,6-23,0%) амбулаторні пацієнти майже не відрізняються від стаціонарних. Основними видами клінічного матеріалу, в якому присутні MRSA є гній, раневий ексудат та мазки з носоглотки. MR-CNS, крім того, досить часто виділяються із сечостатевого тракту. У цих же видах клінічного матеріалу часто присутні стафілококи з пограничною резистентністю до метіциліну. Основна частка MR-ізолятів стафілококів походить від пацієнтів хірургічного профілю. Серед CNS клінічного походження MR-ізоляти належать переважно до видів S. haemolyticus і S. cohnii ssp. cohnii, а BS-штами представлені в основному S. epidermidis і S. haemolyticus. Епідеміологічний аналіз дозволив встановити сезонні та вікові особливості поширення інфекцій, спричинених MRS. На основі співставлення антибіотикотипів виділених штамів ідентифіковано ряд внутрішньолікарняних спалахів MRS-інфекції у великих багатопрофільних стаціонарах. За схильністю до внутрішньогоспітального епідемічного поширення MRS розташовуються в наступному порядку: MRSA > MR-CNS >> BSSA > BS-CNS.

З’ясовано регіональні особливості чутливості до антибіотиків різних груп виділених MR - і BS-штамів S. aureus та CNS. Регіональні ізоляти MRS закономірно характеризуються значною резистентністю до цефалоспоринів, але 66,7-80,0% з них виявляють чутливість до карбапенемів (іміпенему і меропенему). Водночас штами MRSA і MR-CNS володіють високою частотою асоційованої резистентності до аміноглікозидів ІІ покоління (62,5-82,7%), макроділів (66,7-100,0%), лінкозамідів (50,0-96,7%), тетрациклінів (73,9-92,4%), нітрофуранів (60,0-85,7%). Лише 33,3-57,2% ізолятів MRSA проявляють задовільну чутливість до рифампіцину і фузидину. Чутливість до фторхінолонів проявляють 25,0-48,2% штамів MRSA, 25,0-57,1% MR-CNS, 50,0-75,2% BSSA і 50-70,9% BS-CNS. За допомогою регресійного аналізу визначено математичні лінійні функції, які описують темпи набування регіональними ізолятами MR-стафілококів резистентності до офлоксацину. У 1998-2004 рр. спостерігалася стабільна швидкість втрати чутливості до офлоксацину в межах 2,83% штамів на рік, яка за останні 2 роки дещо сповільнилася (до 1,83% штамів на рік).

Регіональні клінічні ізоляти MRS в цілому володіють задовільною чутливістю до ванкоміцину. Середній рівень чутливості до ванкоміцину в штамів MRSA вищий (МПК 2,35 мкг/мл), ніж у MR-CNS (МПК 3,89 мкг/мл). Проте в лікувальних закладах м. Івано-Франківська зареєстровано внутрішньолікарняні спалахи інфекції ванкоміцинрезистентними (VR-) стафілококами та штамами із зниженим рівнем чутливості до ванкоміцину, випадки носійства (в тому числі назофарингеального) цих мікроорганізмів серед клінічно здорових осіб, що робить загрозу їх глобального поширення у регіоні цілком реальною. Серед ізолятів MRSA виявлено 1,93% штамів VISA (S. aureus з помірною чутливістю до ванкоміцину, МПК 8 мкг/мл). Серед клінічних штамів MR-CNS частота поширення VI-CNS становить 12,0%, VR-CNS (з МПК 16-32 мкг/мл) – 6,0%. Переважна більшість VI-CNS і VR-CNS належить до S. haemolyticus (66,6% виявлених ізолятів).

На основі цілеспрямованого пошуку і відбору сформовано тестувальні панелі сучасних клінічних штамів стафілококів з різними профілями антибіотикорезистентності для вивчення протимікробних властивостей природних і синтетичних сполук. У цих штамів фенотипічно ідентифіковано класичну детермінанту метіцилінрезистентності (продукцію пеніцилінзв’язуючого білка PBP2¢) та детермінанти асоційованої резистентності до антибіотиків інших груп, зокрема ефлюксні механізми резистентності до фторхінолонів (помпа NorA), макролідів (MsrA), тетрациклінів (TetK).

Пошук похідних 4-азолідонів з активністю відносно MRS. В результаті тотального високоефективного скринінгу 154 нових синтетичних сполук з тіазолідиновими і спорідненими гетероциклами на 6 штамах MecA– і 7 штамах MecA+ стафілококів та наступного тестування на 50 клінічних ізолятах S. aureus і CNS ідентифіковано три нові класи похідних 4-азолідонів із значною протимікробною активністю відносно MRS:

5- [2-(арилметилокси) - 5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-они;

2,4,5-тризаміщені 4-спіранові похідні тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом;

похідні 6-оксо-5,6-дигідро [1,3] тіазоло [2,3-b] [1,2,4] тріазол-6-ону.

Досліджені 5-ариліден-2-тіоксотіазолідин-4-они є новою групою ефективних інгібіторів ферментів біосинтезу пептидоглікану S. aureus – MurC (Sim M. M. etc., 2002) і MurG (Helm J. S. etc., 2003). Встановлено критичний позитивний вплив 2-тіоксотіазолідин-4-онового фрагменту в поєднанні з 2-бензилокси-5-нітрофенілметиліденовим радикалом на антимікробну дію. В якості оптимальної структури з протистафілококовою активністю ідентифіковано 5- [2-бензилокси-5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-он (сполука L131). Подальше ускладнення каркасу молекули за рахунок введення додаткових замісників у 2-бензилокси-5-нітрофенілметиліденовий залишок і особливо у різні позиції тіазолідинового циклу негативно відображається на протимікробній активності. Сполука L131 володіє мікромолярним діапазоном протимікробної активності відносно стафілококів (для MecA- S. aureus МБсК 3,85 мкг/мл, МБцК 19,55 мкг/мл; для MecA+ S. aureus – 6,73 і 26,48 мкг/мл відповідно). Її протистафілококова активність близька до активності хлоргексидину та етонію і значно переважає інші антисептики порівняння (ріванол, тімол, мірамістин, повідон-йодид).

Встановлено, що 4-спіранові похідні тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом відносно MRSA активніші, ніж відносно MSSA. При цьому 2,4-дизаміщені спіранові похідні помітно поступаються за активністю 2,3,4-тризаміщеним і особливо 2,4,5-тризаміщеним. Структурою-лідером на основі проведеного тестування визначено сполуку L115 – 5-феніл-1,10b-дигідропіразоло [1,5-с] [1,3] бензоксазино-2-спіро-4¢- [5¢-(2¢¢-хлор) - бензилметиліден] тіазолідин-2¢-он (відносно MRSA МБсК 20,66 мкг/мл, МБцК 48,68 мкг/мл).

В ході докінгових і 3D-QSAR досліджень перевірено гіпотезу про можливість блокування 4-спірановими похідними тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом активного центру ензиму MurB синтезу пептидоглікану (рис.1).

Рис.1. Біохімічна роль ензиму MurB та імітування похідними 4-тіазолідонів фосфатної групи його природного ліганду.

Задовільні значення скорінгових функцій, що оцінюють якість та енергію зв’язування докованих лігандів (досліджуваних сполук) з молекулою мішені отримано лише для структури 1HSK ферменту MurB S. aureus. Гіпотеза про можливість імітування взаємодії фрагменту фосфатної групи уридиндифосфат-N-ацетилглюкозаміну енолпірувату (Andres C. J. etc., 2000) підтвердилася тільки для активних щодо стафілококів сполук L115 та L103. Cаме 2-оксо-група при тіазолідиновому циклі в цих сполуках відтворює водневі зв’язки атома оксигену фосфату (природнього ліганду UDP-Glc-NAc-EP) з атомами водню амінокислотних залишків Gly-67 та Gly-65 ензиму MurB. У результаті аналізу докованих позицій визначено можливі шляхи модифікації структури для сполук-лідерів з метою покращення афінітету до MurB та протимікробної активності.

На основі виконаних досліджень запропоновано стратегію пошуку нових протимікробних сполук серед 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем, яка включає комбінаторний підхід до синтезу з комп’ютерною систематизацією даних, поєднання традиційного та віртуального скринінгу і дизайну, QSAR-аналіз. Визначено структурні вимоги для молекулярного дизайну антимікробних 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем.

Із врахуванням прогностичних даних 2D-QSAR аналізу шляхом цілеспрямованого синтезу отримано похідні 6-оксо-5,6-дигідро [1,3] тіазоло [2,3-b] [1,2,4] тріазол-6-ону (сполуки L-1558 і L-1369), активність яких поширюється на MS - і MR-стафілококи (для MRSA МБсК 18,57-27,60 мкг/мл, МБцК 41,02-74,30 мкг/мл). Співвідношення МБцК/МБсК (2,00-3,17) і характер кривих, що характеризують динаміку росту культур MSSA і MSRA, вказують на не різко виражену бактерицидну активність сполук L-1558 і L-1369. За здатністю викликати двократне продовження тривалості періоду генерації (Ki) в культурах MecA– і MecA+ S. aureus сполуки L-1558 і L-1369 практично не відрізняються (65,0-65,4 мкг/мл для MecA– S. aureus 209-Р і 63,8-75,0 мкг/мл для MecA+ S. aureus "Кунда").

В ході досліджень встановлено, що 55,0% сполук із випадково сформованої вибірки похідних 4-азолідонів істотно підвищували чутливість до оксациліну MecA+ S. aureus "Кунда". Найбільш активними у цьому відношенні виявилися похідні 5- [2-(R-бензилокси) - 5-нітрофенілметиліден] -2-тіоксотіазолідин-4-онів (сполуки L-127 і L-1985). Виражений синергізм з оксациліном спостерігався при концентраціях вказаних сполук 12,5 мкг/мл (1/8–1/16 їх МПК для тест-штаму). Дещо слабшу, але стабільно постійну здатність потенціювати протимікробну дію оксациліну відносно MRSA проявили похідні 2-оксо-норборнено [2¢,3¢; 5,6] тіопірано [2,3-d] [1,3] тіазолу (2 сполуки із 2 тестованих: L149 і L1445), 4-ізонікотиноїлгідразонові похідні 2-оксотіазолідину (4 сполуки із 4 тестованих: Ш-17, Ш-20, Ш-21 і Ш-22), а також отримані шляхом цілеспрямованого синтезу на основі прогностичних даних 2D-QSAR аналізу N-(R-феніл) - тіазол-5-іл-ацетаміди (сполуки L-1558 і L-1995).