Вперше з’ясовані відмінності клітинної реакції слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів при урогенітальних інфекціях, що полягали у порушенні проліферативно-репаративної реакції на запалення з явищами клітинного поліморфізму та розвитком плоскоклітинної метаплазії циліндричного епітелію при хламідіозі; посиленому розвитку дегенеративно-дистрофічних змін епітеліальних клітин слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів при уреаплазмозі. Вперше встановлені особливості клітинної реакції слизових оболонок в залежності від локалізації інфекційно-запального процесу. Доведено, що клітини слизової оболонки уретри жінок виявилися найбільш чутливими до дії збудників – зокрема, їх реакція характеризувалася втратою специфічних рис - циліндричні клітини шляхом метаплазії перетворювались в плоскоклітинні елементи.
Практичне значення одержаних результатів.Встановлені особливості мікробного спектру, імунологічних та цитоморфологічних порушень дозволяють підвищити ефективність лікування хворих з інфекційно-запальними захворюваннями сечовивідних та статевих шляхів за рахунок призначення клініцистом адекватної етіотропної та імунотропної терапії.
Доведена доцільність виконання цитологічного методу у комплексі діагностичних заходів урогенітальних інфекцій при одночасному дослідженні етіологічного чинника та цитоморфологічних змін епітеліоцитів вогнища ураження.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було представлено на міжнародній науковій конференції «Актуальные вопросы борьбы с инфекционными болезнями» (2003, Харків); ІІ Всеросійському конгресі з медичної мікології (2004, Москва – Російська Федерація); 6-й міжнародній конференції «NewDevelopmentsinProstateCancerandProstateDiseases» (2005, Paris – France); ІІ З’їзді нефрологів України (2005, Харків); VІІ Українській науковій конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (2005, Київ); нефрологічному семінарі (2005, Санкт-Петербург – Російська Федерація); VIIІ Українській науковій конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (2006, Київ).
Публікації. Основні результати досліджень по темі дисертації викладено у 14 публікаціях: 7 статтях у фахових журналах та 7 тезах доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях та з’їздах.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 167 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень з викладеними результатами, аналізом та узагальненням досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 18 таблицями та 29 рисунками. Список використаної літератури включає 202 джерела, з них 70 – англомовних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
В огляді літератури, що складається з трьох підрозділів, узагальнено та проаналізовано сучасні дані щодо особливостей організації епітеліального покриву, системи місцевого імунітету слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів у жінок та чоловіків в нормі та за наявності патології. Розглянуто біологічні властивості найбільш значущих збудників інфекційно-запальних захворювань сечостатевої системи - хламідій та уреаплазм.
Згідно до мети і завдань роботи було досліджено біологічні зразки, отримані з слизових оболонок сечовивідних та статевих шляхів, сеча та кров 270 чоловіків та 630 жінок (900 обстежених хворих).
Для мікробіологічних досліджень використовували сечу, мазки із піхви, зскребки із слизових оболонок уретри та цервікального каналу, секрет передміхурової залози та еякулят. Мікробіологічні дослідження зразків патологічного матеріалу включали виділення на поживних середовищах та ідентифікацію культур бактерій, молікутів (M.hominis,U.urealyticum), грибів роду Candida (Руденко, 1980; Меншиков, 1987; Лисин та інші., 1988).
Зскребки клітин з слизових оболонок уретри та цервікального каналу отримували ложкою Фолькмана, вносили в транспортне середовище для дослідження методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), одночасно виготовляли мазки на знежирених предметних скельцях, висушували їх на повітрі, фіксували 96% етанолом або сумішшю Нікіфорова з подальшим цитологічним дослідженням.
Специфічні нуклеотидні послідовності ДНК C.trachomatis, M.hominis, M.genitalium, U.urealyticum, G.vaginalis, N.gonorrhoeaeтаT.vaginalis визначали в ПЛР з використанням праймерів та обладнання виробництва фірм “ДНК-технологія”, “Биоком” та “Амплісенс” (РФ).
Цитоморфологічні дослідження виконували методом світлової мікроскопії. Препарати забарвлювали за Романовським-Гімза (Меньшиков, 1987; Базарнова, 1994; Хмельницкий, 1999). У препаратах досліджували ознаки, що характеризують перебіг запального процесу: тип та кількість клітинних елементів запалення; тип та характер розташування епітеліальних клітин, стан цитоплазми та ядер епітеліоцитів. Оцінювали кількість слизу, клітинного детриту та наявність фібринозних мас (Белянин, 1998). У зскребках визначали клітини з цитоплазматичними включеннями, що характерні для хламідій, «ключові» клітини, характерні для гарднерел, трихомонади, гонококи ті іншу мікрофлору.
Сироватки крові всіх хворих тестували у ІФА на присутність специфічних антитіл (IgG) до антигенів C.trachomatis, U.urealyticum, M.hominisтаC.albicans. В роботі використовували тест-системи для ІФА виробництва “Orgenics” (Ізраїль), “Вектор-Бест” (Росія) та ТОВ “Укрмедсервіс” (Україна). Для обліку результатів використовували планшеточний рідер Labsystems “Multiscan”, (Фінляндія).
Для аналізу показників місцевого імунітету було розроблено спеціальну методику виконання змивів з цервікального каналу та шийки матки у жінок та з уретри у чоловіків. Змиви виконували 0,9% стерильним розчином NaCl до отримання зскребків з метою уникнення можливої контамінації зразків кров’ю. Після ретельного перемішування змиви центрифугували при 1,5 тис. об/хв протягом 20 хв та відбирали надосадкову рідину для дослідження гуморальних показників місцевого імунітету. У надосадковій рідині визначали такі показники гуморальної ланки місцевого імунітету:
- рівень секреторного IgA та загальних імуноглобулінів M та G класів;
- рівень лактоферину;
- рівень лізоциму;
- гемолітичну активність комплементу.
Рівень s-IgA та загальних імуноглобулінів класу A, M та G виконувли у ІФА та методом радіальної імунодифузії (РІД) в гелі за Mancini (Mancinietal., 1970). Рівень лізоциму (мурамідази) визначали біологічним методом. Тест виконували з використанням препарату добової культури M. lysodeicticus(Меньшиков, 1987). Активність комплементу визначали гемолітичним методом (Меньшиков, 1987).Рівень лактоферину визначали у ІФА з використанням комерційної дослідницької тест-системи виробництва НВО “Вектор-Бест” (Росія). Осад використовували для дослідження клітинної ланки місцевого імунітету. Фагоцитуючі клітини отримували зі змивів на градієнті щільності фікол-верографін 15-хвилинним центрифугуванням зразків при 1500 об/хв.Функціональну активність фагоцитуючих клітин визначали культуральним методом (Пастер, 1989). Бактерицидну активність фагоцитів визначали мікрометодом у НСТ-тесті (Меньшиков, 1987; Пастер, 1989). Статистичну обробку отриманих данихвиконували за стандартними методами варіаційної статистики з використанням програмиMSExcel.
У розділі 3 проаналізовано частоту виявлення мікроорганізмів різного таксономічного походження у жінок та чоловіків з різними нозологічними формами захворювань сечостатевих органів у відповідному біологічному матеріалі (табл. 1).
Таблиця 1
| Діагноз | Обстежено: | Виявлено: | |||
| абс.число | %,M±m | бактерії*,%, M±m | уреаплазми,%, M±m | хламідії,%, M±m | |
| Уретрит | 32 | 12±0,3 | 30±5,0 | 11±2,5 | 47±2,5 |
| Уретропростатит | 106 | 39±0,5 | 38±1,1 | 11±4,0 | 8±4,0 |
| Простатит | 89 | 33±0,5 | 53±0,9 | 14±4,0 | 4±2,0 |
| Неплідність | 12 | 4±0,2 | 67±13 | 75±3,0 | 25±3,0 |
| Інше ** | 31 | 11±0,3 | 28±8 | 20±2,0 | - |
Примітка: * - мається на увазі сумарна кількість виділених мікроорганізмів групи кишкової палички, стрептококів та стафілококів;
** - інший привід звернення до лікаря: захворювання статевого партнера, обстеження з приводу супутнього захворювання
У табл. 1 представлена частота інфікування бактеріями, уреаплазмами та хламідіями різного біологічного матеріалу у чоловіків з різними нозологічними формами запальних захворювань сечостатевих органів. Вибір збудників був обумовлений тим, що частота виділення бактерій та уреаплазм була найвищою серед інших збудників у всіх групах обстежених жінок та чоловіків, а етіологічна роль хламідій є приоритетною у контексті сучасної епідеміології урогенітальних інфекцій. Як видно з табл. 1, найбільшу групу складали особи з простатитами та уретропростатитами. У цій групі хворих зафіксована найбільша частота виділення бактерій - переважно з секрету передміхурової залози. У чоловіків з діагнозом неплідність частота виявлення мікроорганізмів у секреті передміхурової залози та еякуляті була найвищою у порівнянні з іншими групами. Особливо це стосується уреаплазм, які виявляли у 75±13% осіб. Частота виявлення хламідій сукупністю методів у даній групі становила 25±13%, але найчастіше специфічні нуклеотидні послідовності хламідій визначали методом ПЛР у чоловіків з діагнозом уретрит у зскребках з слизової оболонки уретри – у 47±13% хворих. Однак, при тестуванні сироваток крові цих хворих у ІФА специфічні IgG до антигенів C.trachomatis у діагностичних титрах було виявлено лише у 15% обстежених, що свідчить про локальний перебіг захворювання. З вищою частотою діагностичні титри протихламідійних антитіл визначалися у чоловіків з уретропростатитами – у 32% обстежених. Загалом, діагностично значущі титри протихламідійних антитіл (IgG) було виявлено у сироватках крові 24% чоловіків. T.vaginalisдіагностували на підставі цитологічних та молекулярно-генетичних досліджень у 8±0,3% чоловіків, у 4±0,2% - у вигляді моноінфекції.