Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз (стр. 3 из 11)

Для вивчення стероїдогенезу зрізи кори надниркових залоз щурів інкубували з ³Н-холестерином ("Ізотоп", Російська Федерація). Екстраговані стероїди розділяли методом двомірної тонкошарової хроматографії на силікагелі КСК [Челнакова и др., 1990], визначали радіоактивність продуктів мічення.

Для характеристики метаболізму фосфатидилхоліну до контрольних та дослідних суспензій клітин кори надниркових залоз морських свинок додавали ³Н-холін ("Amersham", Велика Британія).Екстракцію ліпідів проводили за методом [Bligh, Dyer, 1959]. Фосфоліпіди розділяли мікротонкошаровоїю хроматографією в системі розчинників: хлороформ : метанол : 28 % аміак (65 : 35 : 5) (1-й напрямок) та хлороформ : ацетон : метанол : оцтова кислота : вода (30 : 40 : 10 : 10 : 5) (2-й напрямок). Водорозчинні метаболіти фосфатидилхоліну розділяли тонкошаровою хроматографією на силікагелі Н ("Merck", Німеччина) в системі розчинників: метанол : 2,4 % NaCl : вода : 28 % аміак (50 : 12,5 : 37,5 : 5). Перед хроматографією до проб додавали аутентичні немічені свідки ("Sigma", США).

АКТГ та пролактин йодували хлораміновим методом [Чард, 1981]. Як ліганд для вивчення зв’язування АКТГ використовували також (3-[¹²⁵I]йодотирозил²³)АКТГ(1-39) ("Amersham", Велика Британія). Стандартна проба для вивчення рецепції містила мічений гормон (100 000 імп./хв), 50-100 мкг білка мікросом або 10⁵-10⁶ клітин. Для визначення неспецифічного зв’язування до проби додатково вносили по 10 мкг/мл неміченого АКТГ або пролактину, а для визначення загального зв’язування – тільки мічений гормон.

Субклітинні фракції адренокортикоцитів отримували методом диференційного ультрацентрифугування з додатковою очисткою ядерної фракції у градієнті щільності сахарози [Buckleyetal., 1988].

Визначення активності протеїнкінази С (ПКС) у субклітинних фракціях клітин кори надниркових залоз людини або щурів проводили з використанням нейрограніну – високоспецифічного лужного пептидного субстрату ПКС, який внаслідок фосфорилювання ПКС змінює заряд та рухається в агарозному гелі до аноду [Uchidaetal., 2000], а нефосфорильований нейрогранін, використаний як негативний контроль, мігрує до катоду. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКС містило трис-HCl буфер, Mg-ацетат, АТР, а також специфічні активатори ферменту (Са²⁺, фосфатидилсерин), нейрогранін та білки досліджуваних субклітинних фракцій.

Специфічну активність протеїнкінази А (ПКА) визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі пептидного субстрату кемптиду внаслідок його фосфорилювання ПКА [Kempetal., 1977]. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКА містило трис-HCl буфер, АТР, активатори ферменту (Mg²⁺, cAMP), кемптид та білки субклітинних фракцій.

Рівень cAMP та cGMP визначали, використовуючи радіоімунологічні набори TRK-432 та -500 відповідно ("Amersham", Велика Британія).

Детекцію ізоформ ПКС, каспази-3, протеїнкіназ, що активуються мітогенами, факторів транскрипції проводили імуноблот-аналізом із використанням моноклональних антитіл [Kurien, Scofield, 2006]. Розділені методом електрофорезу у поліакриламідному гелі за присутності додецилсульфату натрію білки [Laemmli, 1970] переносили на нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Після інкубації з первинними і вторинними антитілами імунні комплекси візуалізували за допомогою реагенту ECL. Після денситометричного визначення інтенсивності засвічення плівки HyperfilmECL результати обробляли у програмі "PhotoCaptMw".

Екстракцію ДНК із зрізів проводили, послідовно інкубуючи адренокортикальну тканину з протеїназою К та рибонуклеазою А [Kostyuchenkoetal., 2005]. Депротеїнізацію проводили сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом. Екстракцію РНК проводили, використовуючи реагент TRIzol LS ("Invitrogen", США).

Реакцію зворотної транскрипції проводили в реакційній суміші, що містила: стандартний буфер для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), хлористий магній, суміш дНТФ, а саме АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ, інгібітор РНКази, зворотну транскриптазу, суміш випадкових гексамерів та 1 мкг екстрагованої РНК. Інкубація в термоциклері проводилась за таких умов: 22 ⁰С – 10 хв, 42 ⁰С – 15 хв, 99 ⁰С – 5 хв, 4 ⁰С – 5 хв.

Реакцію ПЛР проводили в суміші, що містила: стандартний буфер для ПЛР, хлористий магній, дНТФ, полімеразу redhottaq, прямий та зворотній праймери до RET тирозинкінази (РТК), комплементарну ДНК, одержану в результаті реакції зворотної транскрипції. Умови інкубації: 95 ^оС – 30 сек, 50 ^оС – 30 сек, 72 ^оС – 1 хв, а потім температуру знижували до 4 ^оС. Кількість циклів становила 30.Продукти ПЛР аналізували в 1,7 %агарозному гелі.

Впродовж всієї роботи використовували кортикотропін А ("Sigma", США),17b-естрадіол, естрадіол бензоат ("Кoch-Ligth", Велика Британія), пролактин великої рогатої худоби (Каунаський завод ендокринних препаратів, Литва). NAE (суміш N-ацилетаноламінів, N-стеароїлетаноламін) було синтезовано в Інституті біології моря (Владивосток, Російська Федерація). о,п’-ДДД було синтезовано в лабораторії оргсинтезу та хімреактивів Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України.

У роботі були використані моноклональні антитіла до ізоформ протеїнкінази С-α, -β₁, -β₂, -γ, -δ, -ε, -η, -θ, -µ -ζ; οротеїнкіназ, що активуються мітогенами – ERK1/2, JNK, p38; факторів транскрипції – с-jun, с-fos; каспази-3 ("CellSignalingTechnology" або "Sigma", США); IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону ("Sigma", США), субстрати нейрогранін та кемптид (Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys та Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly відповідно, "Sigma", США) нітроцелюлозна мембрана HybondC та реагенти для посиленої хемілюмінесценції ("AmershamLifeScience", Велика Британія), набори для проведення полімеразної ланцюгової реакції ("Roche", Франція), агароза, трис, протеїназа К, рибонуклеаза А ("Sigma", США), колагеназа ("Fluka", Швейцарія), усі солі, NaOH, HCl ("Merck", Німеччина).

Для характеристики генеральної сукупності вираховували середнє значення М та середню похибку m, які представлено у ілюстративному матеріалі. Різницю між двома вибірками визначали за параметричним t-критерієм Стьюдента, непараметричним U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні та дисперсійним аналізом за F-критерієм Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження месенджерних систем, що опосередковують сигнали актг в адренокортикальних клітинах. Регуляція кортикотропіном адренокортикальної функції забезпечується здебільшого за рахунок прямого фосфорилювання cAMP-залежною ПКА специфічних білків, а також стероїдогенних факторів, що беруть участь в реакціях стероїдогенезу, змінюючи його швидкість. Не викликає сумнівів, що cAMP/ПКА-залежна месенджерна система не є єдиною системою опосередкування дії АКТГ в клітині. Гормон здатний активувати різні протеїнкінази, проте інші сигнальні каскади, залучені до перенесення сигналів АКТГ, досліджені значно менше, ніж cAMP/ПКА-залежний. Особливу увагу дослідників в цьому аспекті привернула протеїнкіназа С. Відомо, що деякі протеїни можуть одночасно бути субстратами для кількох кіназ, що є важливим загальним принципом інтеграції пострецепторних сигналів в клітині. Це істотно ускладнює розуміння механізмів опосередкування регуляторних сигналів АКТГ та можливої взаємодії між різними месенджерними системами. Потрібно також зазначити, що механізми дії АКТГ досліджувались раніше здебільшого на лініях пухлинних клітин надниркових залоз, спробу оцінки дії гормону на умовно нормальних тканинах надниркових залоз людини ми провели вперше.

Участь цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової протеїнкінази С в реалізації ефектів АКТГ.На початку досліджень необхідним було з’ясування специфіки механізмів перенесення регуляторного сигналу АКТГ в корі надниркових залоз людини із залученням цAMФ-залежної ПКА та серин/треонінової ПКС. В дослідах використовували післяопераційні умовно нормальні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці Інституту. АКТГ in vitro у концентрації 0,2 од./100 мг тканини не призводить до активації ПКА та ПКС ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях. При збільшенні концентрації кортикотропіну до 2 од./100 мг тканини протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає у 4,5 рази порівняно з контрольними пробами у випадку ПКА та у 1,4 рази у випадку ПКС. Визначення розподілу ізоформи ПКС-a в субклітинних фракціях клітин після інкубації у середовищі з різним вмістом АКТГ за допомогою імуноблот-аналізу показало, що із збільшенням концентрації кортикотропінукількість ферменту зростала в ядерній фракції (рис. 1), не змінюючись ні в мікросомній, ні в цитозольній фракціях адренокортикоцитів. Отже, суттєва роль у трансдукції сигналу кортикотропіну в адренокортикальних клітинах людини може належати не тільки мембранозв’язаній формі ПКС, але і ядерній ПКС.

Рис. 1. Вміст a-ізоформи ПКС в ядерній фракції адренокортикоцитів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини при різних концентраціях АКТГ.

А - Вестерн-блот аналіз. Б - сканограма плівки. В - узагальнені результати п’яти дослідів. 1 – контроль, 2 – АКТГ 0,2 од./100 мг тканини, 3 – АКТГ 2 од./100 мг тканини.** - вірогідний вплив АКТГ, p < 0,05; критерій Стьюдента.

Субклітинний розподіл ПКС та експресія рецепторних тирозинкіназ в пухлинах надниркових залоз людини. Відомо, що у проліферативних процесах важливу роль відіграє ПКС, яка є важливою ланкою внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, порушення яких призводить до ініціації та прогресії онкогенезу. Зміни рівня експресії ізоферментів ПКС та їхньої активності мають значний вплив на процеси проліферації та можуть бути залучені до процесів пухлинної трансформації у корі надниркових залоз. Тому доцільним було визначити загальну активність протеїнкінази С і розподіл ізоформ ПКС у субклітинних фракціях клітин адренокортикальних тканин надниркових залоз людини за умов норми і різноманітних патологічних станів. Визначення активності ПКС здійснювалось у цитозольній, мікросомній та ядерній фракціях пухлин та умовно нормальних тканин. Статистично вірогідна різниця спостерігається між активністю ПКС у мікросомній фракції клітин умовно нормальної та пухлинної тканин і не спостерігається у цитозолі та ядрах.В препаратах ядерної, цитозольної та мікросомної фракцій клітин кори надниркових залоз людини було проаналізовано експресію десяти ізоферментних форм ПКС. Найвищий рівень експресії спостерігався у випадку ПКС-α. На отриманих знімках чітко виявляються смуги білка у діапазоні молекулярної маси 80 кДа, що відповідає молекулярній масі α-ізоформи ПКС (рис. 2).