Роль циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А і С в реалізації ефектів N-ацилетаноламінів в адренокортикоцитах.Дослідження впливу етаноламінів, N-ацильованих сумішшю жирних кислот, на продукцію cAMP корою надниркових залоз людини дозволило показати, що помітне зниження вмісту cAMP в адренокортикальній тканині спостерігається вже при концентрації NAE 0,3 мкг/мл, при збільшенні концентрації NAE вміст cAMP продовжує зменшуватись і становить 0,083 ± 0,005 пмоль/мг тканини при концентрації NAE 33 мкг/мл. В контрольних пробах вміст cAMP становить 0,200 ± 0,012 пмоль/мг тканини. Рівень cGMP за цих умов залишається незмінним.
Для з’ясування можливості модуляції стероїдогенезу за рахунок змін активності ПКА і ПКС ми провели пряме визначення впливу NAE на активність ферментів в субклітинних фракціях. Суміш N-ацильованих похідних етаноламіну змінює активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини, як це видно з табл. 6.
Таблиця 6
Вплив NAE на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини
| Фермент | Цитозольна фракція | Мікросомна фракція | |||||
| NAE, мкг/мл | NAE, мкг/мл | ||||||
| Контроль | 3,3 | 33 | Контроль | 3,3 | 33 | ||
| ПКА | 12,18 ± 1,30 | 8,50 ± 0,28* | 8,03 ± 0,89* | 8,68±1,12 | 8,95 ± 1,13 | 7,35 ± 0,56 | |
| ПКС | 9,08 ± 1,28 | 8,33 ± 0,65 | 8,95 ± 1,08 | 7,50 ± 0,43 | 11,13 ± 1,66* | 8,55 ± 1,23 | |
Примітка. * –вірогідно по відношенню до контролю, p < 0,05; критерій Стьдента; n=4.
У цитозольній фракції клітин спостерігається вірогідне зниження активності ферменту, починаючи з концентрації NAE3,3 мкг/мл. При збільшенні концентрації NAE до 33 мкг/мл протеїнкіназна активність знижується на 34 % у порівнянні з контрольними пробами. У досліджених концентраціях NAE in vitro не впливає на активність ПКА у мембранній фракції адренокортикоцитів.
Внесення суміші NAE до середовища інкубації в жодній з досліджуваних концентрацій не впливає на активність ПКС в цитозольній фракції клітин кори надниркових залоз (табл. 6). У мембранній фракції зростання протеїнкіназної активності спостерігається тільки при одній концентрації NAE -3,3 мкг/мл.
Виходячи з отриманих даних, виявлені прямі стимулювальні ефекти N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз можуть пояснюватись залученням ПКС до перенесення регуляторних сигналів NAE в адренокортикоцитах. Привертає увагу той факт, що для суміші NAE концентрація 3,3 мкг/мл виявилася найбільш біологічно активною в дослідах in vitro як в корі надниркових залоз людини, так і самок щурів. Можливо, ПКС не є єдиною протеїнкіназою, що активується NAE в адренокортикоцитах. Для деяких типів клітин існують дані щодо активації анандамідом, 2-арахідоноїлгіцеролом та D9-тетрагідроканабінолом протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також кінази фокальних контактів [Lepicieretal., 2003].
Вплив NAE на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканинах надниркових залоз людини.Вважається, що при пошкодженні багатьох тканин і, в першу чергу, нервової тканини та серцевого м’язу утворюються NAE, які виконують захисну функцію щодо пошкодженої тканини. Стабілізаційні ефекти NAE щодо травмованих тканин можуть бути пов’язані з їх протекторним впливом на клітинні мембрани. Нашу увагу NAE привернули такими ефектами, як здатність викликати і посилювати апоптоз та пригнічувати проліферацію у різних типах тканин [Гула та ін., 2006; Maccarrone et al., 2002], в тому числі і в пухлинній тканині надниркових залоз людини [Kostyuchenkoetal., 2005]. Проте, незважаючи на проведені дослідження, антипроліферативний та проапоптичний ефекти NAE в різноманітних пухлинах кори надниркових залоз вивчені ще дуже недостатньо.
Тому метою наступного етапу досліджень було визначення залежності ступеня фрагментації ДНК в деяких пухлинних тканинах надниркових залоз людини від вмісту NAE (N-стеароїлетаноламіну та суміші ненасичених NAE) в інкубаційному середовищі (табл. 7). In vitro суміш NAE, що містила похідні етаноламіну здебільшого з ненасиченими залишками жирних кислот, не змінює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині у випадках альдостером та андростером. Водночас в умовно нормальній тканині у випадку феохромоцитом сумарний об’єм фрагментів ДНК зростає майже в два рази (табл. 7).
Очевидно, реакція тканини надниркових залоз у значній мірі визначається її генетичними особливостями і, відповідно, біохімічними змінами, що відбуваються в тканині внаслідок патологічного перетворення. Слід відзначити, що ступені фрагментації ДНК у пухлинних і умовно нормальних ділянках у межах однієї залози тканин кори надниркових залоз, одержаних від хворих альдостеромою, феохромоцитомою, андростеромою в значній мірі різняться між собою (табл. 7). Різна інтенсивність апоптичних явищ у клітині може пояснюватися перебудовою генетично детермінованих процесів у патологічно змінених клітинах у порівнянні з нормальною тканиною [Berninietal., 2002].
Таблиця 7
Порівняльна характеристика інтенсивності апоптичних процесів (%) у пухлинних і умовно нормальних ділянках в межах однієї залози під впливом суміші NAE
| Джерело тканини | Суміш NAE (3,3 мкг/мл) | |
| пухлина | умовно нормальна | |
| Альдостерома | 143,6 ± 8,6 ** | 109,8 ± 7,7 |
| Андростерома | 102,4 ± 13,7 | 106,4 ± 9,1 |
| Феохромоцитома | - | 198,0 ± 42,2 ** |
Примітка. За 100 % прийнята фрагментація ДНК за умов інкубації без NAE, ** – вірогідна різниця з контролем без NAE, р < 0,01, критерій Стьюдента; n = 4.
Найбільш чутливими до дії NAE пухлинами виявилися альдостероми, фрагментація ДНК в них збільшується більш ніж на 30 % порівняно з умовно нормальною тканиною. У випадку андростером фрагментація ДНК залишається без змін, у випадку феохромоцитом чутливою до дії NAE є умовно нормальна тканина надниркових залоз. Відомо, що при феохромоцитомі істотно посилюється кортикостероїдогенез в прилеглій адренокортикальній тканин [Wolfetal., 2005]. Цей факт може бути поясненням встановленого нами збільшення фрагментації ДНК під впливом NAE майже на 100 % саме у випадку феохромоцитоми (табл. 7).
Той факт, що N-ацильовані похідні етаноламіну здатні вибірково вражати пухлинну тканину альдостером, помітно не впливаючи і не завдаючи шкоди нормальній, може бути підґрунтям для розробки нових підходів оптимізації хіміотерапії пухлин надниркових залоз.
Дослідження участі протеїнкіназ у перенесенні регуляторного сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах
Іони калію відіграють значну роль в регуляції адренокортикальної функції. Відомо, що К+ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є тлом, що модулює ефекти інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну [Chenetal., 1999; Prattetal., 1989]. Проте регуляція синтезу мінералокортикоїдів іонами калію є дослідженою значно гірше порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є Са2+/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condonetal., 2002; Gangulyetal., 1992]. В той же час в регуляції найважливіших метаболічних функцій клітини, зокрема в регуляції стероїдогенезу, значну роль відіграють циклічні нуклеотиди. Ми провели дослідження на умовно нормальних та гіперплазованих тканинах кори надниркових залоз людини, які свідчать про участь в трансдукції регуляторних сигналів іонів К+ cAMP, ПКА та ПКС. Для того щоб прослідкувати можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах людини, ми вивчали розподіл основної ізоформи ПКС у корі надниркових залоз, ПКС-α, в субклітинних фракціях після інкубації зрізів в середовищі з різним вмістом К+. Встановлено, що кількість ферменту за присутності іонів калію в інкубаційному середовищі є більшою в мікросомах. Таке накопичення ПКС-α в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. В цитозольній фракції адренокортикоцитів вміст α-ізоформи ПКС залишається без змін.
Ми також вивчали зміни активності ПКС у субклітинних фракціях зрізів адренокортикальної тканини людини під впливом змін концентрації іонів калію. Суттєва активація ПКС спостерігалась в мікросомній фракції: при концентрації калію 8,5 мМ активність ПКС визначалась у мікросомах на рівні 11,09 ± 2,33 нмоль субстрату х хв-1 х мг-1 білка. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з кіназною активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К+. Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах адренокортикоцитів морських свинок показало значне посилення її активності внаслідок дії К+ [Пушкарьов, 2005]. Натомість, інші протеїнкінази в ядрах не активувались, або їх активність навіть мала тенденцію до зменшення.
Активація ПКС в ядрах, можливо, пов’язана з фосфорилюванням деяких транскрипційних чинників, а через них посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та білки-регулятори стероїдогенезу (StAR). Таким чином, активація ПКС зі збільшенням концентрації К+ спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок [Пушкарьов, 2005], які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну фосфоінозитидів та мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо і значною мірою визначає рівень синтезу альдостерону в клубочковій зоні залози. Щоб оцінити можливу роль cAMP-залежної ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К+ в корі надниркових залоз людини, визначали вміст нуклеотиду в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі.