Отримані дані розкривають конкретні патогенетичні механізми розвитку діабетичної невропатії та свідчать про важливу роль порушень NAD-модуляторної системи в розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Вперше показано, що зростання специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за цукрового діабету корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але спостерігається зниження вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD+. При цьому виявлено, що не існує прямої залежності між рівнем NAD+ у головному мозку та його зв’язуванням синаптичними мембранами.
Результати проведених досліджень свідчать про опосередкований полі-АDP-рибозополімеразою (Parp) механізм порушення біодоступності NAD+ при розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Зокрема, вперше продемонстровано можливий зв’язок між зростанням активності цього NAD-залежного ферменту у клітинних ядрах та зниженням вмісту динуклеотиду у головному мозку діабетичних щурів, що пов’язано з репарацією розривів ДНК в умовах виявленої інтенсифікації за діабету пероксидокислювальних та вільнорадикальних процесів. Вперше встановлено, що посилення моно-ADP-рибозилювання Gs-білків та активація сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, який сприяє підвищенню вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.
Механізм позитивної нейротропної дії за діабету нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, введених у терапевтичних дозах, включає нормалізуючий ефект цих сполук на рівень NAD+ і специфічне зв’язування динуклеотиду синаптичними мембранами головного мозку, що корелює з нормалізацією процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну ізольованими синаптичними закінченнями.Здатність вітаміну РР і його похідного ефективно коригувати NAD-опосередковані мембранні процеси за експериментальної діабетичної невропатії, принаймні частково, є результатом антиоксидантної дії цих сполук та інгібування процесів моно- і полі-АDP-рибозилювання білків.
Практичне значення одержаних результатів. Позитивна нейротропна дія вітаміну РР та його похідних, яка на рівні контролю синаптичної активності реалізуються опосередковано через NAD-зв’язувальний білок синаптичних мембран, обумовлює можливість та доцільність їх застосування з метою нормалізації специфічних нейрохімічних процесів у синаптичних закінченнях та забезпечення ефективної нейропередачі за діабетичної невропатії.Крім цього, продемонстровано можливість успішного використання нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК у фармакологічних дозах як інгібіторів загального ADP-рибозилювання та сполук з антисорбітоловими та антиоксидантними властивостями у лікуванні даного захворювання. Результати проведених досліджень також підтверджують, що порушення процесів рецепції NAD+ синаптичними мембранами та його нейромодуляторної дії можуть бути спільним проявом розвитку різних захворювань центральної нервової системи.
В цілому, проведені дослідження розширюють уявлення щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та нікотиноїл-ГАМК у головному мозку та складають теоретичне підґрунтя для подальшого вивчення досліджуваних сполук та інших біоактивних похідних на їх основі як препаратів, що використовуються з метою цілеспрямованої фармакологічної корекції порушень функціонування ЦНС за діабетичної невропатії та інших патологій нервової системи.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто підібрано та критично проаналізовано великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою запланованого наукового дослідження. Дисертантом розроблено конкретні схеми вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати, підготовлено до друку публікації. Експериментальна частина роботи виконана особисто здобувачем. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – зав. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, член-кор. НАН України, д.б.н., проф. Донченко Г.В. та пров. науков. співр. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна, д.б.н. Кучмеровською Т.М.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VI з’їзді ендокринологів України (2001, Київ); VI міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (2002, Москва); VIII Українському біохімічному з’їзді (2002, Чернівці); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (2005, Київ); міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (2005, Пущино, Росія); II Європейському Конгресі з фармакології (1999, Угорщина); V Всесвітньому Конгресі IBRO з нейронаук (1999, Єрусалим, Ізраїль); IX, XI, XII Конгресах “NEURODIAB Diabetic Neuropathy” Європейської Асоціації з Вивчення Діабету, EASD (1999, Маастріхт, Нідерланди; 2001, Абердін, Шотландія; 2002, Балатонфюред, Угорщина;); III об’єднаному З’їзді DFSG (група з вивчення діабетичної стопи) та NEURODIAB (2004, Регенсбург, Німеччина); 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43-му Щорічних Конгресах Європейської Асоціації з Вивчення Діабету (1999, Брюссель, Бельгія; 2000, Єрусалим, Ізраїль; 2001, Глазго, Великобританія; 2002, Будапешт, Угорщина; 2004, Мюнхен, Німеччина; 2005, Афіни, Греція; 2006, Копенгаген-Мальмо, Данія-Швеція; 2007, Амстердам, Нідерланди); 19-му Всесвітньому Діабетичному Конгресі (2006, Кейптаун, Південна Африка).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з яких 6 - статті у фахових наукових виданнях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, заключної частини, висновків та списку використаних джерел, який містить 330 посилань. Робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту та проілюстрована 11 таблицями та 29 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Розглянуто некоферментні функцій вітаміну РР та його біологічно активних похідних у забезпеченні процесів життєдіяльності клітин; проведено аналіз сучасних уявлень про значення вітаміну РР та його похідних за різних функціональних станів центральної нервової системи; особливу увагу приділено нейрохімічним порушенням за цукрового діабету та висвітлено можливу роль вітаміну РР у їхній корекції.
Матеріали та методи дослідження. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар вагою 130-160 г, яких утримували в стандартних умовах віварію при відповідному освітленні та годуванні ad libitum.
Експериментальний цукровий діабет 1 типу у щурів викликали одноразовим введення стрептозотоцину ("Sigma") з розрахунку 70 мг/кг маси тіла внутрішньоочеревинно (Chatfopadhyay S. et al, 1997). Розвиток діабету контролювали за зростанням рівня глюкози крові, яку визначали глюкозооксидазним методом (Marks V., 1963). В експериментах використовували тварин через 4 тижні після індукції діабету з рівнем глюкози 14,5-16,5 ммоль/л, у яких, за даними літератури, розвивається діабетична невропатія. Тваринам вводили NAm або нікотиноїл-ГАМК (N-ГАМК) щоденно в дозі 20, 100 та 200 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно, упродовж 7-14 діб.
Модель інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі створювали: а/ введенням тваринам NAm та/або N-ГАМК на 6 годин або упродовж 2 тижнів по 20, 100 або 200 мг на кг маси тіла; б/ введенням NAm за 6 годин до забою у дозі 500 мг на кг маси тіла (Чаговець Р.В. та інш., 1977).
Синаптосоми та синаптичні мембрани головного мозку виділяли методом диференційного центрифугування в градієнті густини сахарози за методом Abita J. et al. (1977). В основу процедури виділення ядер клітин головного мозку було покладено метод, розроблений Blobel G. et al. (1966).
У кислотних екстрактах головного мозку, які одержували при його обробці 0,6 н HClO4 (при температурі 0-4оС), визначали вміст NAD+, NADP+, ATP та сорбітолу ферментативними методами (Bergmeyer H.U., 1974).
Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ (питома активність 269 мКи/ммоль, "Amersham", Англія) синаптичними мембранами головного мозку щурів визначали радіолігандним методом (Варфоломеев С.Д. и др., 1982) як різницю між загальним (кінцева концентрація [U-14C]NAD+ 0,32 мкМ) та неспецифічним зв’язуванням у присутності 1000-кратного надлишку неміченого динуклеотиду.
Зворотне поглинання [2-14C]серотоніну (57 мКи/ммоль, "Amersham"), вивчали в інкубаційному середовищі об’ємом 1 мл, що містило 100 мМ Na – фосфатний буфер, рН 7,4; 120 мМ NaCl; 5 мМ КСl; 1 мM CaCl2; 1 мM MgCl2; 0,5 мM Na2HPO4; 10 мМ глюкозу; 10 мкМ іпроніазид (Gandhi V.C., 1990). До інкубаційного середовища вносили 0,5 мг білка синаптосом та преінкубували 5 хв при 37oC. Після цього додавали мічений серотонін, кінцева концентрація якого становила 1,48 мкмоль/л. Після закінчення інкубації (10 хвилин за температури 370 С) проби швидко фільтрували через фільтри GF/C "Whatman" та промивали 15 мл 0,1 М фосфатного буферу. Поглинену синаптосомами радіоактивність на висушених фільтрах підраховували у РС-101 на рідинно-сцинтиляційному спектрометрі SL-30 ("Intertechnique", Франція).
Для визначення вивільнення [2-14C]серотоніну фільтри з навантаженими міченим серотоніном синаптосомами поміщали у перфузійні камери, приєднані до перистальтичного насосу і промивали 6 мл інкубаційного середовища (в яке вносили досліджувані агенти) зі швидкістю 1,0 мл/хв. Фракції з радіоактивністю, що вивільнилась, збирали кожної хвилини упродовж 6 хв і підраховували радіоактивність в сцинтиляційній рідині РС-103.
Мембранний потенціал вимірювали за поглинанням ліпофільного катіону тетра[3Н]фенілфосфонію броміду ([3H]ТФФ+, 20 Ки/ммоль, "Amersham") синаптосомами головного мозку щурів (Pauwels P.J., 1986). Кінцева концентрація катіону становила 2,5 нмоль/л. Величину потенціалу розраховували як різницю поглинання [3H]ТФФ+ синаптосомами головного мозку за високої (1) та низької (2) концентрації K+, використовуючи рівняння Нернста: Е = ─ 26,7ln[3H]ТФФ1+/[3H]ТФФ2+, де [3H]ТФФ1+ та [3H]ТФФ2+ - радіоактивність на фільтрах після інкубування синаптосом у середовищі 1 та 2. За умов проведених експериментів величина Е дорівнювала 0 при концентрації KCl 120ммоль/л.