Особистий внесок здобувача.Дисертант проаналізувала літературні джерела за обраною темою. Автором особисто було отримано та проаналізовано первинні матеріали дисертаційного дослідження, а саме: було проведено цитогенетичне дослідження з аналізом хромосомних препаратів лімфоцитів периферичної крові пацієнтів із підозрою на ССА і, вибірково, членів їхніх родин та молекулярно-цитогенетичне дослідження з аналізом отриманих препаратів пацієнтів з підозрою на ССА. Дисертантом було проаналізовано отримані дані, підготовлено публікації до друку. Самостійно написано та оформлено всі розділи дисертаційної роботи. Автор щиро вдячна професору Альберту Шинцелю (Інститут медичної генетики, Цюріх, Швейцарія) за допомогу в проведенні молекулярно-генетичної діагностики у частини пацієнтів з функціональною делецією хромосоми 15при СПВ.
Апробація результатів дисертації.Результати досліджень доповідались на І Всеросійському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2002), I Українському конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю „Метаболічні спадкові захворювання” (Харків, 2003), 14thEuropeanStudents’ Conference (Berlin, 2003), Науково-практичній конференції з міжнародною участю „Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), Науковій конференції „Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Київ, 2005), 7thBalkanMeetingonHumanGenetics (Skopje, RepublicofMacedonia, 2006), SecondEasternEuropeanConferenceonRareDiseasesandOrfanDrugs “Fosteringresearchonrarediseasesineasterneuropeancountries” (Plovdiv, Bulgaria, 2006), П’ятому Російському конгресі „Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2006), VIII Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні питання педіатрії” (Київ, 2006), на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Актуальні питання медичної генетики” (Київ, 2007), XI Ювілейному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2007), на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні методичні підходи до аналізу здоров’я” (Луганськ, 2007), на конференції з медичної генетики з міжнародною участю „Плід – як частина родини” (Харків, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 друкованих праць, серед них: 3 статті у виданнях, затверджених ВАК України, 1 стаття – у закордонному журналі, 2 статті у збірниках наукових праць, 10 тез, опублікованих у матеріалах з’їздів, симпозіумів та конференцій.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 129 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає описання матеріалів та методів, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Дисертація містить 14 таблиць та 11 рисунків. Список використаних джерел охоплює 182 найменування, з них 50 – кирилицею та 132 роботи латиницею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Було досліджено матеріал від 78 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом одного з ССА, а саме: СВХ – 3 пацієнта, синдром „котячого крику” – 1 пацієнт, СВБ – 21 пацієнт, ССМ – 2 пацієнта, СПВ – 19 пацієнтів, с-м мікроделеції 22q11.2 – 31 пацієнт, синдром „котячого ока” – 1 пацієнт. Вік пацієнтів коливався від 10 днів до 12 років. Також було досліджено матеріал від 6 батьків та 4 членів родин пробандів.
Матеріалом дослідження були лімфоцити периферичної крові осіб з різних регіонів України, у яких з 1998 по 2006 рік під час медико-генетичного консультування та/або знаходження на лікуванні було запідозрено ССА. Пацієнти проходили консультування на кафедрі медичної генетики НМАПО імені П.Л. Шупика, у медико-генетичному центрі УДСЛ „ОХМАТДИТ”, у медико-генетичному відділенні Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Дитячої клінічної лікарні №1 та знаходилися на лікуванні у 3-му та 4-му хірургічних відділеннях Інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМНУ, у відділенні новонароджених Науково-практичного медичного центру дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України. При виявленні у пробандів структурних перебудов хромосом досліджували каріотип їх батьків.
Для вирішення поставлених завдань у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика було отримано та проаналізовано препарати хромосом метафазної і прометафазної конденсації у 78 пацієнтів з підозрою на ССА та у 6 батьків і 4 членів родин. Для отримання хромосом метафазної конденсації до культуральної суміші PBmax (Gibco) додавали по 0,5 мл цільної крові пробанда (по 0,4 мл крові від новонародженої дитини). Культивування проводили за стандартною методикою (Hungerfordetal., 1965).
Для отримання хромосом прометафазної конденсації додатково використовували метотрексат на 50-й годині культивування та 5-бром-дезоксиуридин на 67-й годині культивування (Зерова-Любимова, Горовенко, 2003). При дослідженні метафазних та прометафазних пластинок для ідентифікації хромосом та виявлення структурних перебудов використовували забарвлення за допомогою барвника Гімза на фосфатному буфері з рН 6,8 (GTG-метод) (Захаров и др., 1982) з попередньою обробкою трипсином. Метафазні та прометафазні пластинки для цитогенетичного аналізу відбирали за загальноприйнятими стандартами (Захаров и др., 1982; Зерова-Любимова, Горовенко, 2003).
Для проведення кількісної та якісної оцінки каріотипу хромосомні препарати після їхнього диференційного забарвлення аналізували за допомогою світлового мікроскопу ARISTOPLAN („Leica”) при збільшенні х1125. FISH-аналіз матеріалу від 71 пацієнта з підозрою на мікроструктурні зміни критичної ділянки досліджуваних хромосом 7, 15, 22 виконано у генетичній лабораторії кафедри медичної генетики НМАПО імені П.Л.Шупика та, частково, в Інституті медичної генетики, Цюріх, Швейцарія, в межах спільного гранту (№7 IP 62652, 7 IP 051778). Препарати хромосом метафазної та прометафазної конденсації отримували за вищенаведеною методикою. Передгібридизаційну, гібридизаційну та післягібридизаційну обробку препаратів було проведено відповідно до стандартного протоколу, що рекомендовано фірмою-виробником ДНК-зондів. Для FISH-аналізу були використані локус-специфічні зонди.
Для ідентифікації мікроделецій в критичних ділянках хромосом 7q11.23, 15q11.2-q13, 22q11.2 отримані препарати аналізували за допомогою люмінесцентного мікроскопу Axioplan 2 (“Zeiss”), з 100-ватною люмінесцентною лампою та набором спеціальних фільтрів (DAPI/FITC/Rhodamine, “Zeiss”).
Запис результатів цитогенетичного аналізу та FISH-аналізу проводили згідно ISCN(1995, 2005).
Результати дослідження та обговорення
Стандартним цитогенетичним методом проаналізовано метафазні пластинки лімфоцитів периферичної крові від 74 пробандів Для 4 пацієнтів застосування стандартного цитогенетичного аналізу було неможливим внаслідок відсутності метафазних пластинок на хромосомних препаратах при неодноразовому повторі культивування матеріалу. У зв’язку з цим подальшу верифікацію діагнозу у цих пробандів проведено із застосуванням FISH-аналізу на інтерфазних ядрах. Також проаналізовано каріотип 6 батьків і 4 родичів пацієнтів.
Результати наведено в табл. 1
Таблиця 1
Співставлення попереднього клінічного та остаточного діагнозів з результатом стандартного цитогенетичного аналізу у пацієнтів з підозрою на ССА
| Попередній клінічний діагноз | Каріотип пробандів | Остаточний діагноз | Кіль-кість |
| с-м Вольфа-Хіршхорна | 46,XY,del(4)(p14.1) | с-м Вольфа-Хіршхорна | 1 |
| с-м Вольфа-Хіршхорна? | 46,XY,del(4)(p16.2) | с-м Вольфа-Хіршхорна | 1 |
| підозра на хромосомну патологію | mos 46,XY,del(4)(p16.2)[15]/ 46,XY[15] | мозаїчний варіантс-му Вольфа-Хіршхорна | 1 |
| с-м „котячого крику” | 46,XY,del(5)(p14.1) | с-м „котячого крику” | 1 |
| с-м Сміта-Мадженіса | 46,XX,del(17)(p11.2р11.2) | с-м Сміта-Мадженіса | 1 |
| с-м Сміта-Мадженіса | 46,XX,inv(9)(p12q12),del(17)(p11.2р11.2) | с-м Сміта-Мадженіса | 1 |
| с-м „котячого ока” | 47,XY,+del(22)(pter→q11.2) | с-м „котячого ока” | 1 |
| підозра на с-м Прадера-Віллі | 45,XX,der(14;22)pat | не встановлено | 1 |
| підозра на с-м Прадера-Віллі | 46,ХХ | не встановлено | 9 |
| 46, XY | не встановлено | 9 | |
| підозра на с-м мікроделеції 22q11.2 | 46,XX,inv(9)(p12q12) | не встановлено | 1 |
| підозра на с-м мікроделеції 22q11.2 | 46,XX,der(12)t(12;22)(q12;q11.2)mat,-22 | не встановлено | 1 |
| підозра на с-м мікроделеції 22q11.2 | 46,ХХ | не встановлено | 12 |
| 46, XY | не встановлено | 15 | |
| підозра на с-м Вільямса-Бойрена | 46,ХХ | не встановлено | 8 |
| 46, XY | не встановлено | 11 | |
| Разом | 74 |
Як видно із результатів, наведених у табл.1 у 6 пробандів з підозрою на ССА та одного пробанда з підозрою на ХП були виявлені типові зміни каріотипу, що дозволило одразу поставити остаточний діагноз. Так, у двох випадках із клінічними ознаками, характерними для СВХ, було підтверджено діагноз – СВХ. В обох випадках делеція охоплювала критичну для розвитку СВХ ділянку 4p16. У першого пацієнта ідентифіковано втрату близько двох третин короткого плеча хромосоми 4 – del(4)(p14.1). Дитина мала важкі ВВР та померла у віці 1 міс. Рання верифікація діагнозу дозволила провести медико-генетичне консультування батьків дитини з приводу планування подальшої вагітності. У другого пацієнта з характерною для СВХ, однак, менш виразною клінічною картиною виявлено делецію у ділянці 4p16.2 та підтверджено діагноз СВХ. У іншого пацієнта з підозрою на ХП виявлено мозаїчний варіант СВХ. Ймовірно, наявність del(4)(p16.2) лише в 50% клітин обумовила стерту клінічну картину, що не дозволило лікарю запідозрити СВХ. Таким чином, наші дослідження збігаються та підтверджують загально прийняте наукове поняття про те, що при СВХ розмір делетованої хромосомної ділянки корелює з фенотиповою картиною та важкістю перебігу захворювання (Zollino, 2000).