Молекулярно-цитогенетична характеристика синдромів сегментних анеусомій (стр. 4 из 6)

В зв’язку з тим, що до розвитку СПВ можуть призводити різні етіологічні чинники, а саме: делеція, мікроделеція в критичній ділянці, функціональна делеція або уніпарентна дисомія та мутація в центрі імпринтингу, навіть наявність двох сигналів локус-специфічного зонду у критичній ділянці 15q11.2-q13 не дозволила спростувати попередній клінічний діагноз. Тому, у 10 осіб із 19 пацієнтів з СПВ остаточний діагноз не було верифіковано (53%).

Отже, при дослідженні каріотипу 71 пацієнта з підозрою на ССА FISH-методом діагноз підтверджено у 40 пацієнтів (51,28%) та спростовано у 21 пацієнта (26,92%). Діагноз не верифіковано у 10 пробандів (12,82%). Таким чином рівень інформативності застосування молекулярно-цитогенетичного методу в нашому дослідженні склав 78,2%.

Важливо відзначити, що із 71 пацієнта для чотирьох (два пробанди з підозрою на СВБ та два пробанди з підозрою на синдром мікроделеції 22) діагноз підтверджено при молекулярно-цитогенетичному дослідженні на інтерфазних ядрах. Така необхідність виникла внаслідок низького мітотичного індексу у цих хворих. На сьогодні, інтерфазний метод посідає значне місце у виявленні ХП при проведенні пренатальної діагностики (Ворсанова, 2006). Наші дані показують, що цей метод може бути методом вибору при необхідності швидкої верифікації діагнозу ССА. Однак, після встановлення або спростування діагнозу на інтерфазних ядрах, обов’язковим є проведення стандартного цитогенетичного аналізу для перевірки наявності інших змін хромосомного набору, що і було нами вище показано.

В зв’язку з тим, що у 10 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом СПВ діагноз не верифіковано, ДНК пацієнтів та їхніх батьків було відправлено на молекулярний аналіз. В результаті проведення аналізу метилування ДНК та мікросателітного аналізу у трьох пацієнтів діагноз СПВ підтверджено, у двох – спростовано. Для 5-ти пацієнтів результати молекулярно-генетичного обстеження виявились не інформативними (6,4%).

Аналіз даних, отриманих при проведенні комплексного дослідження пацієнтів з підозрою на ССА із залученням стандартного та високочутливого цитогенетичних методів, FISH-аналізу та молекулярного аналізу показав, що процес підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу є складним та охоплює декілька етапів. Комплексне застосування цитогенетичних, молекулярно-цитогенетичних та молекулярних методів дозволило верифікувати діагноз у 93,6% пацієнтів з підозрою на ССА.

У відповідності з одержаними результатами, нами було створено загальний алгоритм лабораторного генетичного обстеження пацієнтів з підозроюна ССА (рис. 2) та розроблено диференційно-діагностичний підхід з цілеспрямованим використанням лабораторних генетичних методів для кожного нозологічного випадку.

Алгоритм лабораторного генетичного обстеження пацієнтів з підозрою на ССА

Перший етап лабораторного генетичного обстеження – цитогенетичний аналіз.

Усім пацієнтам із попереднім клінічним діагнозом ССА проводять стандартне цитогенетичне дослідження.

· У разі виявлення делеції/дуплікації критичних ділянок хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 або їхньої участі у структурних перебудовах з іншими хромосомами з втратою критичної ділянки діагноз підтверджується. Пацієнт та члени його родини направляються для завершення медико-генетичного консультування до лікаря-генетика.

· При виявленні інших структурних перебудов, у яких критична ділянка не задіяна та при необхідності встановлення точок розривів-з’єднання можливим є використання високочутливого цитогенетичного аналізу.

· Виявлення структурних перебудов у каріотипі дитини обумовлює необхідність каріотипування батьків дитини, що дозволяє встановити батьківське походження перебудованих хромосом та уточнити точки розривів у хромосомах, які брали участь у структурній перебудові.

· При відсутності метафазних пластинок на хромосомних препаратах одразу переходять до другого етапу –використовуютьFISH-аналіз на інтерфазних ядрах.

Варто зазначити, що для пацієнтів, у яких діагноз був підтверджений за допомогою FISH-методу на інтерфазних ядрах, у подальшому ми рекомендуємо провести стандартний цитогенетичний аналіз із метою виключення інших структурних перебудов у каріотипі, оскільки вони можуть впливати на стан дитини.

При характерній клінічній картині ССА і нормальному каріотипі переходять до

другого етапу – молекулярно-цитогенетичної діагностики.

· FISH-діагностику проводять усім пацієнтам з попереднім клінічним діагнозом ССА, у яких на першому етапі не виявлено делецію критичної ділянки досліджуваної хромосоми.

· При виявленні мікроделеції критичної ділянки діагноз підтверджується, і родина повертається до лікаря-генетика для подальшої консультації.

· Якщо мікроделецію критичної ділянки не виявлено, діагноз спростовується, і пацієнт направляється до лікаря-генетика. У цьому випадку найвірогідніше, що

пацієнт має патологію іншого генезу і тому потребує подальшої диференційної діагностики.

· Винятком із цього правила є пацієнти з хворобами геномного імпринтингу (наприклад, синдром Прадера-Віллі). Якщо під час проведення FISH-аналізу не виявлено мікроделеції в каріотипі пробанда з попереднім клінічним діагнозом СПВ, це є приводом для подальшого дослідження із застосуванням методів молекулярного аналізу з метою виявлення функціональної делеції, уніпарентної дисомії або мутації центру імпринтингу. Відповідно з результатами молекулярного аналізу у таких випадках діагноз або підтверджується або спростовується, що є приводом для диференційної діагностики. Молекулярне дослідження також рекомендовано при необхідності визначення батьківського походження мікроделеції, виявленої на попередніх етапах обстеження та при плануванні наступної вагітності в родині, яка має дитину з ССА.

Отже, розроблений нами алгоритм дозволяє вибрати оптимальні шляхи проведення генетичного обстеження пацієнтів з підозрою на ССА та може бути використаний для визначення подальшої стратегії медико-генетичного консультування родин, що мають дитину з ССА.

На основі одержаних результатів та враховуючи рекомендований нами алгоритм, було розроблено диференційно-діагностичний підхід до формування груп пацієнтів з підозрою на ССА з метою індивідуалізованого та цілеспрямованого використання цитогенетичних, молекулярно-цитогенетичного та молекулярно-генетичного методів. З 78 обстежених пацієнтів ми сформували три групи. До першої групи увійшли пацієнти з наступними синдромами: Вольфа-Хіршхорна, „котячого крику”, Сміта-Мадженіса та „котячого ока”. При діагностиці цих нозологічних форм ХП економічно та стратегічно виправданим є застосовування стандартного цитогенетичного методу. У разі, якщо делецію/дуплікацію не було виявлено, рекомендуємо одразу застосовувати молекулярно-цитогенетичний метод з використанням локус-специфічних зондів на відповідні критичні ділянки. Високочутливий цитогенетичний метод у даної групи пацієнтів може бути застосований при необхідності уточнення точок розривів-з’єднання хромосомного матеріалу, визначеного при стандартному методі.

До другої групи увійшли пацієнти з підозрою на синдром Вільямса-Бойрена та синдром мікроделеції 22q11.2. Для верифікації діагнозу у пацієнтів з цієї групи ми рекомендуємо одночасне застосування стандартного цитогенетичного та молекулярно-цитогенетичного методів діагностики ХП. Такий підхід дає можливість прискорити верифікацію діагнозу, що найбільш важливо при необхідності термінового кардіо-хірургічного втручання.

До окремої третьої групи увійшли пацієнти з підозрою на синдром Прадера-Віллі, для яких верифікація діагнозу є складною, багатоступеневою і потребує поступового залучення використаних нами методів діагностики. Для встановлення остаточного діагнозу ми рекомендуємо одночасно застосувати стандартний цитогенетичний та молекулярно-цитогенетичний методи діагностики на першому етапі верифікації діагнозу СПВ, та, якщо делецію/мікроделецію критичної ділянки хромосоми 15 не виявлено, продовжити дослідження із використанням методів молекулярного аналізу.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі вперше запропоновано новий підхід щодо оптимізації генетичної діагностики ССА, який базується на визначенні інформативності стандартних та високочутливих цитогенетичних і молекулярно-цитогенетичного методів та створенні алгоритму генетичного обстеження пацієнтів з підозрою на ССА. Показно гетерогенність прояву кожного із досліджених синдромів як за клінічними, так і за цитогенетичними характеристиками, і необхідність застосування комплексу лабораторних генетичних підходів для підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу.

1. Доведено необхідність застосування стандартного цитогенетичного методу на першому етапі верифікації діагнозу ССА, який дозволив підтвердити попередній клінічний діагноз ССА у 8,97% пацієнтів, виявити інші хромосомні перебудови у 3,8% пацієнтів, встановити додатковий діагноз – синдром трисомії за довгим і, частково, коротким плечем хромосоми 12, який не відноситься до групи ССА. Встановлено батьківське походження дериватних хромосом у 33,3% випадків та обгрунтовано необхідність цитогенетичного аналізу у батьків при виявленні змін каріотипу у їхньої дитини.

2. Показано, що застосування високочутливого цитогенетичного методу дозволяє виявляти мікроделеції (3,8%) та конкретизувати результати стандартного цитогенетичного аналізу і точки розривів при структурних перебудовах хромосом.