Морфофункціональні закономірності змін в міокарді щурів при експериментальному гіпотиреозі та його корекції (стр. 2 из 6)

Об’єм та структура роботи. Матеріали дисертації викладені на 276 сторінках машинописного тексту, текстова частина займає 152 сторінки. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали та методи досліджень”, п’яти розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Список цитованої літератури містить 338 джерел, серед яких 168 – опубліковані кирилицею та 170 – латиницею. Дисертація ілюстрована 93 рисунками та 17 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Об’єктом дослідження стали серця від 212 статево-зрілих безпородних щурів–самиць, яким у віці 3-4 місяці хірургічно моделювали стан гіпотиреозу. Вивчали чотири групи тварин, відповідно до поставлених завдань.

I група - віварійний контроль (неоперовані щури, 15 тварин);

II група - тварини, яким моделювали стан гіпотиреозу (70 тварин);

III група - тиреоїдектомовані щури, які отримували гормонзамісну терапію L-тироксином («Фармак», Україна) в дозі 10мкг/кг маси тварини (64 тварини);

IV група - прооперовані тварини, які отримували комбіноване лікування L-тироксином («Фармак», Україна) у дозі 10мкг/кг perosта кальцитоніном (препарат «міакальцик», «Novartis», Швейцарія) у дозі 1,0 МО/кг (58 тварин);

V група – щури, яким після видалення щитовидної залози була проведена трансплантація фетальної щитоподібної залози (5 тварин).

Утримання, догляд за тваринами, маркування і всі маніпуляції проводили відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей» (Страсбург, 1985). Комісією з біоетики Національного медичного університету імені О. О. Богомольця встановлена відповідність проведених наукових досліджень етичним вимогами згідно наказу МОЗ України №231 від 01.11.2000 року.

Гіпотиреоз моделювали хірургічно розробленим методом, підтвердженим патентом.

Біоелектричну активність міокарда піддослідних щурів вивчали за електрокардіограмами у II стандартному відведенні з реєстрацією кривих на Мінгографі-34 («Siemens-Elema», Швеція).

Проникність еритроцитарних мембран вивчали за допомогою показника мембранних процесів – осмотичної резистентності еритроцитів (ОРЕ). ОРЕ визначали за методом Дейсі [Гиріна О. М., 2004], принцип якого полягає в зміні ступеня гемолізу еритроцитів (у відсотках) в серії забуферених гіпотонічних розчинів натрію хлориду (в розведеннях від 0,5% до 0,1%, рН 7,4).

Для контролю ефективності гіпотиреозу, у дослідних тварин досліджували вміст тироксину в сироватці крові імуноферментним методом. Вміст рівня іонізованого та загального кальцію в сироватці крові визначали титруванням.

Процеси перекисного окислення ліпідів оцінювали за рівнем вторинних продуктів ліпопероксидації (малонового діальдегіду) у гомогенатах міокарда, які визначали спектрофотометричним методом при спонтанній неіндукованій ліпопероксидації та індукованому ферментативно-залежному ліпопереокисленні з використанням в ролі прооксиданта систему НАДФН⁺ та сульфат заліза (ІІ).

Вивчення жирнокислотного складу ліпідів міокарду у експериментальних щурів проведено методом газорідинної хроматографії на базі лабораторії газової хроматографії Інституту проблем патології. Міокард експериментальних тварин гомогенізували у фізіологічному розчині, підготовку біологічного матеріалу ліпідів тканин серця експериментальних та контрольних щурів і газохроматографічний аналіз проводили за існуючою методикою [Трофімова Т. С. із співавт., 2005]. За даним методом отримано патент.

Матеріалом для електронномікроскопічного дослідження були ділянки міокарду правих передсердь та лівих шлуночків щурів. Фрагменти міокарду фіксували в 2,5% розчині глютарового альдегіду на какодилатному буфері з дофіксацією в 1% розчині осмієвої кислоти. Зневоднювали у спиртах 70%, 80%, 90%, 100% концентрації та ацетоні. Заливали в суміш епон – аралдит, згідно загальноприйнятій методиці [Карупу В. Я., 1984]. Напівтонкі та ультратонкі зрізи з блоків отримували на ультратомах LKBIII (Швеція) та Reihart (Швеція). Напівтонкі зрізи забарвлювали метиленовим синім та за Hayat [Hayat М., 1986] і досліджували за допомогою фотооптичної системи „Olympus”. Ультратонкі зрізи контрастували насиченим розчином 2% уранілацетату та цитрату свинцю. Препарати досліджували під електронними мікроскопами ЕМ-100 та ПЕМ – 125К.

Для морфометричних досліджень використовували програму «Органела», розроблену на базі лабораторії електронної мікроскопії Інституту проблем патології. В передсердних кардіоміоцитах підраховували співвідношення різних типів гранул [Коростишевская И. М., 1989]. І тип представляє собою популяцію гранул, що формуються. ІІ тип гранул представляє зрілі форми органел, які депоновані в передсердних кардіоміоцитах. ІІІ тип гранул складається з органел, вміст яких виводиться з клітини. Різні типи гранул підраховували на негативах, отриманих при однаковому збільшенні, які містили фрагменти передсердних кардіоміоцитів, зріз яких пройшов через центр клітини.

В кардіоміоцитах лівого шлуночка визначали об’ємну і числову щільність мітохондрій, середню площу мітохондрій, фактор форми мітохондрій, об’ємну щільність міофібрил та співвідношення об’ємних щільностей мітохондрій і міофібрил, згідно принципам стереометричного аналізу [Автанділов Г. Г., 2007].

Трансплантацію фетальної щитоподібної залози експериментальним тваринам здійснювали в день тиреоїдектомії. Донорський матеріал брали від плодів щурів на 9-10 добу гестації. Трансплантували заготовлені фетальні щитоподібні залози в дуплікатору очеревини здухвинної кишки.

Статистична обробка здійснювалась методами варіаційноі статистики, за допомогою програмного забезпечення StatisticaforWindiws 6.0 (MicrosoftCorporation, USA). Обраховувались дані морфометричного та біохімічних досліджень. По кожному з показників обчислювалося середнє значення та стандартна похибка для кожної з піддослідних тварин. Вірогідність отриманих даних оцінювали за параметричними і непараметричними критеріями достовірності.

Результати досліджень та їх обговорення. Морфофункціональний стан міокарду щурів в динаміці експериментального гіпотиреозу.В результаті тиреоїдектомії у щурів формується стан стійкого гіпотиреозу, про що свідчить достовірне зниження концентрації вільного тироксину плазми крові більше, ніж вдвічі, порівняно з контролем (рис. 1). Встановлене зниження концентрації загального кальцію в плазмі крові впродовж всіх 100 діб дослідження, проте, рівень іонізованого кальцію в крові залишався в межах норми, визначеної для інтактних тварин, що свідчить про відсутність гіпопаратиреозу у досліджуваних тварин [Федоров С. В., 2006; JacobsD., 2004].

Рис. 1. Графік змін концентрації вільного тироксину в плазмі крові в динаміці експерименту. По осі абсцис – терміни досліджень та контрольне значення, по осі ординат – концентрація вільного тироксину в плазмі крові (нмоль/л).

Аналіз отриманих результатів комплексного дослідження функціонального стану та структури міокарду дозволив виявити стадійність формування патоморфологічних змін в ньому. Ці зміни мали однаковий характер та спрямованість як в міокарді правого передсердя, так і лівого шлуночка, проте їх виразність була більшою в міокарді правого передсердя. За характером виявлені процеси в міокарді можна розділити на три основні стадії: реактивних змін, компенсаторно-пристосувальних процесів та декомпенсації.

Реактивні зміни в міокарді набувають свого розвитку в ранньому післяопераційному періоді (через 14 та 35 діб після операції). Вже на цій стадії активувались процеси як спонтанного, так і НАДФН⁺-індукованого механізмів перекисного окислення ліпідів (концентрація малонового діальдегіду в гомогенаті міокарда в першому випадку виросла на 116%, а у другому – на 56%). Тобто, реактивні зміни в міокарді характеризувались активацією переважно процесів спонтанного утворення вільних радикалів. Ці дані узгоджуються даними інших авторів [Ланкин В. З., 2000; Реброва Т. Ю., 2007;Сомова О. В., 1999; Ткаченко О. Р., 1994]. Ймовірною причиною ланцюгової активації вільнорадикального окислення ліпідів є розмежування окисно-відновних процесів в мітохондріях.

Одними з перших в процес перекисного окислення ліпідів включаються поліненасичені жирні кислоти за рахунок наявності в них нестійких зв’язків [Савицький И. В., 1982]. Отримані нами результати визначення жирнокислотного спектру ліпідів міокарда дають право вважати, що для періоду реактивних змін характерним є перекисне окислення саме поліненасичених жирних кислот, вміст яких зменшився на 10%. Поліненасичені жирні кислоти в структурі фосфоліпідів беруть участь у формуванні мембран клітин. Причому, чим більший вміст цих жирних кислот в мембрані, тим нижче її в’язкість та тим вищою є активність рецепторних, транспортних та сигнальних систем [Галявич А. С., 2006]. Зниження вмісту поліненасичених жирних кислот в мембранах організму сприяє підвищенню їх проникності та зменшенню міцності. Ми спостерігали це на прикладі мембран еритроцитів тиреоїдектомованих щурів. Виявилось, що через 14 діб рівень нестійких форм еритроцитів в 0,45% NaCl підвищилась на 95,8% порівняно з контролем.

Описані біохімічні та патофізіологічні процеси мали своє морфологічне відображення в міокарді. В патологічний процес включаються обмінні мікросудини, компоненти інтерстиційного простору та самі кардіоміоцити. Виявлений гетеротипізм змінених кардіоміоцитів відображає грубі механізми їх селекції в умовах різкого дефіциту гормонів щитоподібної залози. Найбільш чутливими до дії патогенного чинника виявляються найбільш активні з функціональної точки зору клітини [Непомнящих Л. М., 1981; Твердохліб І. В., 1996].

Характерною ознакою реактивних процесів в міокарді через 14 діб була поява ділянок апоптозно змінених клітин, які втрачають контакти з сусідніми кардіоміоцитами, мають пікноморфні ядра, ущільнену цитоплазму з деструктурованими міофібрилами, розширеними канальцями саркоплазматичної сітки, які не утворюють тріади, активними мітохондріями з дещо ущільненими кристами. Окрім кардіоміоцитів, спостерігались апоптозно змінені ендотеліоцити.