Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу (стр. 2 из 5)
Отримані у дисертаційній роботі дані використовуються у навчальному процесі під час викладання спецкурсів, які читаються на кафедрі біохімії біологічного факультету ЛНУ імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень дисертант безпосередньо брала участь у створенні моделі стрептозотоцинового діабету, виконала весь обсяг експериментальних досліджень, статистичну обробку отриманих результатів, здійснила пошук та аналіз джерел наукової літератури згідно з темою кандидатської дисертації. Автор особисто брала участь у підготовці публікацій до друку. Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів методом скануючої електронної мікроскопії виконано спільно із к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів, формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником, д.б.н., завідувачем кафедри біохімії, проф. Сибірною Н.О. Співучасть співробітників кафедри біохімії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на IV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); І з’їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції „Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006); ІХ З’їзді Укр. біохім. тов. (Харків, 2006); третій Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”(Львів, 2007); 2-му З`їзді Українського Товариства Клітинної Біології (Київ, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, які включають 6 статей у фахових наукових журналах та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях, з’їздах, конгресах.
Структура та обсяг роботи. Дисертація містить наступні розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 124сторінках друкованого тексту і проілюстровано 12 рисунками та 13 таблицями. Список літератури включає 177 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані стосовно етіології ЦД 1-го типу та його ускладнень, а також експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано морфофункціональний стан системи еритрону, киснево-транспортну функцію крові та біологічну систему L-аргінін/NO у нормі і за умов досліджуваної патології.
Матеріали і методи досліджень. Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) у щурів викликали введенням стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла дочеревинно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали глюкозооксидазним методом з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини з питною водою: L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах: 1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-аргінін; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG.
Кількість еритроцитів та ретикулоцитів визначали згідно методик [Сибірна та ін., 1997]. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів визначали за методикою, описаною [Ілюхін и др., 1982 ]. Для отримання цитологічних препаратів клітин кісткового мозку застосовували комбіноване фарбування за Папенгеймом.
Активність NO-синтази визначали як описано в роботах [Онуфриев, 1995, Сумбаев, 2000] у нашій модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967].
Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий та ін., 1998]. Нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну визначали у гемолізатах, отриманих з використанням 33 мМ К+/Na+-фосфатного буферу (рН 7,36). Процес дезоксигенації гемоглобіну здійснювали у вакуумі [Иванов, 1975] і контролювали спектрофотомерично. Концентрацію гемоглобіну у гемолізатах визначали за методикою [VanKampen, 1961]. Реакцію відновлення NO2-аніонів за участю дезоксигемоглобіну ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO2 та реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм [Gross, 1999]. Електронні адсорбційні спектри досліджували за допомогою спектрофотометра UV-VIS “SpecordM-40” (Німеччина). Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів та аскорбінової кислоти [Gross, 1999].
Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів здійснювали методом скануючої електронної мікроскопії. Виділення, відмивання та фіксацію еритроцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Сидоров и др., 2001, Новицкий и др., 2001]. Готові зразки вивчали в скануючому електронному мікроскопіJEOLJSM-T 220 AScanningmicroscope (Японія) Для отримання кількісної характеристики морфологічних форм еритроцитів у кожному препараті статистично підраховували 500 клітин, використовуючи класифікацію [Боднарь и др., 2003, Погорелов и др., 2005].
Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом, який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ 1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Глікозильований гемоглобін визначали колориметричним методом [Van Kampen, 1983].
Результати досліджень обробляли статистично з використанням коефіцієнта Ст’юдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Цитологічні та фізико-хімічні показники периферичної крові та кісткового мозку щурів у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу. Показано, що за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) відбувається збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові у 1,4 разів, їх добової продукції у 1,3 разів, а швидкості дозрівання у півтора рази порівняно до норми. Розвиток стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого та глікозильованого гемоглобіну (Hb). Збільшення кількості фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією системи еритрону на гіпоксичний стан, який розвивається за умов ЦД. При аналізі цитологічних препаратів кісткового мозку виявлено зниження процентного вмісту поліхроматофільних (у 1,3 разів) та оксифільних (у 1,7 разів ) нормоцитів при стрептозотоциновому діабеті, яке можна пояснити їх сповільненим дозріванням та швидкими темпами елімінації ретикулоцитів у русло крові. Отримані нами результати ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.
Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Згідно даних, приведених в табл.1, введення L-аргініну у нормізбільшувало NO-синтазну активність еритроцитів приблизно на 30%. L-NAME – структурний аналог L-аргініну та неспецифічний інгібітор, який конкурентно інгібує всі форми NOS, знижував активність досліджуваного ферменту на 29%, а дія аміногуанідину – селективного інгібітора іNOS, була дуже слабкою. За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-аргініну викликало зниження активності NOS. Це можна пояснити інгібуванням активності ферменту за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. При введенні інгібіторів при ЕЦД спостерігалося пригнічення активності NOS в еритроцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології.
Табл. 1
Активність NOS і вміст нітритів та нітратів в еритроцитах периферичної крові за досліджуваних умов ( М±m, n=14)
| ПоказникиУмови | Активність NOS, пмольNADPH/хв на 1мг білка | NO3- + NO2-, мкM |
| Контроль | 0,831 ± 0,028 | 15,732 ± 2,173 |
| Контроль + L–аргінін | 1,080 ± 0,098* | 22,322 ± 2,078* |
| Контроль + L-NAME | 0,590 ± 0,041* | 6,459 ± 0,024* |
| Контроль + AG | 0,673 ± 0,051* | 14,654 ± 1,354 |
| ЕЦД | 1,288 ± 0,101* | 33,623 ± 1,799* |
| ЕЦД + L–аргінін | 0,843 ± 0,070** | 26,924 ± 1,852** |
| ЕЦД + L-NAME | 0,360 ± 0,033** | 7,164 ± 0,709** |
| ЕЦД + AG | 0,450 ± 0,039** | 11,198 ± 1,215** |
Примітка. Тут і далі:
* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05
** - різниця вірогідна порівняно із діабетом, р<0.05