ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар масою 140-250 г і білих мишах-самцях лінії СВА масою 18-26 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію ОДМУ. Досліди проводили згідно вимог GLPта комісії біоетики ОДМУ (протокол № 41В от 14 вересня 2007 р.). В експериментах використовували нові БАР на основі оксіетилідендифосфонатогерманатів з біолігандами – нікотиновою кислотою, нікотинамідом і магнієм (відповідно МІГУ- 4, 5, 6), які були створені на кафедрі загальної хімії та біополімерів ОНУ ім. І.І. Мечнікова під керівництвом з.д.н.т. України, професора І.Й. Сейфуліной.
Дослідження впливу нових БАР на поведінкові реакції інтактних тварин проводилося на моделях прямої актометрії, «відкритого поля» [Буреш Я. и соавт., 1991]., обертового стрижня [Dunham N.W. et al., 1957] і умовної реакції активного уникнення [Буреш Я. и соавт., 1991], а також аналізувалися фармакологічні ефекти сумісного введення нових БАР зі стандартними депримуючими (гексенал, 20,0 мг/кг; тіопентал-натрію, 50,0 мг/кг; діазепам, 5,0 мг/кг) і збуджуючими (фенамін, 1,0 мг/кг) засобами [Кресюн В.Й., 1973]. МІГУ-4, 5, 6 вводили внутрішньочеревно (в/о) дозами 1/10 ЛД50 (34,0; 56,0; 45,0 мг/кг відповідно), 1/20 ЛД50 (17,0; 28,0; 23,0 мг/кг відповідно), 1/40 ЛД50 (8,5; 14,0; 12,0 мг/кг відповідно) і 1/80 ЛД50 (4,2; 7,0; 6,0 мг/кг відповідно).
Для вивчення протисудомної дії досліджуваних БАР використовували моделі гострої і хронічної судомної активності, рекомендовані Міжнародною протиепілептичною лігою як скринінгові моделі: максимальних електрошокових судом (МЕС) [Swinyard et al., 1957], 6-Гц судом [Barton M.E. et al., 2001], [Swinyard et al., 1957], аудіогенних судом [Mohler M.H., 1986], судом, викликаних підшкірним (п/ш) введенням пентилентетразолу (ПТЗ) дозою 85 мг/кг, пікротоксину (ПКТ) дозою 2,7 мг/кг, бікукуліну (БКК) дозою 2,5 мг/кг, стрихніну дозою 1,2 мг/кг, внутрішньошлуночковим введенням N-метил-D-аспартату (NMDA) дозою 0,2 нг/5 мкл (клонічні судоми) і 3,0 нг/5 мкл (тонічні судоми). Осередки епілептичної активності (ЕпА) створювали за допомогою аплікації на кору мозку щурів розчинів стрихніну, бензилпеніциліну-натрію і ацетилхоліну за методикою [Шандра О.А. та співавт., 1999]. Кіндлінг у мишей і шупів моделювали в/о введенням ПТЗ у підпороговій дозі 30 мг/кг і транскорнеальною стимуляцією (8 мА, 60 Гц, 4 с) за методикою [Шандра О.А. та співавт., 1999]. При моделюванні судомних синдромів розраховували середньоефективні (ЕД50), середньотоксичні (ТД50) дози та захисний протисудомний індекс (співвідношення ТД50/ЕД50) [Стефанов О.В., 2001]. Тваринам контрольних груп в/о вводили аналогічні об'єми фізіологічного розчину.
Підготовку переживаючих зрізів гіпокампу здійснювали за методикою, описаною М.И. Митюшовым (1985). З метою визначення характеру змін фокальних відповідей на дію досліджуваних БАР в омиваючий розчин додавали розчини МІГУ-5 (100-2000 мкмоль), фенітоїну (25-100 мкмоль), карбамазепіну (25-100 мкмоль), вальпроату кальцію (50-100 мкмоль) і кромокаліну (25-100 мкмоль).
Як препарати порівняння дії досліджуваних БАР на різних моделях судомного синдрому та для їх ізоболографічного аналізу, який проводили за методиками [Tаllaridа R.J., 1992; Luszczki J.J. et al., 2006; Jonker D.M. et al., 2007], використовували такі антиконвульсанти: карбамазепін, фенітоїн, вальпроєва кислота, левітирацетам, топірамат, габапентин, ламотриджин виробництва «Sigma» (США). Для з'ясування типу взаємодії БАР зі стандартними антиконвульсантами використовували 3 фіксовані співвідношення доз компонентів 1:3, 1:1 і 3:1 на моделі 6-Гц-індукованих судом.
Паркінсонічний синдром відтворювали шляхом п/ш введення оксотреморину (0,25 мг/кг,«Sigma», Німеччина), в/о введення резерпіну (2 мг/кг, Рауседил, Гедеон Рихтер, Угорщина) за методикою Nickel B. et al. [1997], введенням каїнової кислоти (30 і 100 нг, «Sigma», Німеччина)у хвостате ядро [Крижановский Г.Н. и соавт., 1981], введенням 6-гідроксидофаміну (6-ГДА) в чорну речовину [Johansson J. et al., 1975]. Як референс-препарати в/о використовували скополаміну гідробромід і метилбромід («Sigma», Німеччина), які вводили дозами 0,5, 5,0, 10,0 мг/кг і 0,005, 0,05, 0,5 мг/кг відповідно, а також флупертин і L-DOPA («Sigma», Німеччина), які вводили дозами 5,0, 10,0 мг/кг і 8,0, 16,0 мг/кг відповідно.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою загальноприйнятих в медико-біологічних дослідженнях методів аналізу з використанням стандартних пакетів комп’ютерних програм[Лапач С. Н. и соавт., 2002].
Результати досліджень. Вплив БАР на поведінку інтактних тварин. У тесті прямої актометрії досліджувані БАР найбільш виразні ефекти мали в дозах 1/20 і 1/10 ЛД50. При цьому максимально пригнічувальний ефект на рухову активність виявив МІГУ-5 дозою 56,0 мг/кг (1/10 ЛД50). В умовах «відкритого поля» під впливом МІГУ-6 (45,0 мг/кг) відзначалося найбільше посилення вертикального (на 33,3%) і горизонтального (на 23,5%) компонентів рухової активності, при цьому під впливом МІГУ-5 (56,0 мг/кг) вони найбільше знижувалися (відповідно на 77,8 і 86,5%). При дослідженні ефектів БАР на м'язову координацію мишей у тесті "обертового стрижня" у жодній з досліджуваних доз МІГУ-4, 5, 6 не спричинювали істотної нейротоксичної дії. В умовах підвищеної рухової активності щурів введення МІГУ-4 у максимальній досліджуваній дозі 34 мг/кг достовірно не впливав на активуючу дію фенаміну, введення МІГУ-5 (45,0 мг/кг) приводило до значного зниження ефектів фенаміну, достовірно зменшуючи прояви горизонтальної і вертикальної рухової активності (відповідно на 50,4 і 67,1%), епізодів грумінгу (на 61,5%), не пригнічуючи дослідницької активності. Введення МІГУ-6 (45 мг/кг) приводило до збільшення показників вертикальної і горизонтальної рухової активності як порівняно з інтактними тваринами (відповідно на 61,5 і 71,7%), так і в умовах введення фенаміну (відповідно на 7,5 і 8,2%).
На моделі тіопентал-викликаного сну МІГУ-4, 5, 6 не мали самостійної здатності викликати сон, однак показали здатність впливати на фармакологічний сон, збільшуючи відсоток заснулих тварин при збільшенні дози БАР. Найбільші відсотки заснулих тварин (66,7 і 91,6%) спостерігалися при введенні МІГУ-5 дозами 28,0 мг/кг і 56,0 мг/кг відповідно. При вивченні здатності нових БАР пролонгувати тіопенталовий сон найбільш виразний депримуючий ефект мав МІГУ-5, який у всіх досліджуваних дозах (14,0, 28,0 і 56,0 мг/кг) достовірно зменшував латентний період засипання (на 34,2, 41,8, 46,8% відповідно) і збільшував тривалість тіопенталового сну (на 0,3, 5,9 і 65,7% відповідно). МІГУ-6 у всіх досліджених дозах збільшував латентний період засипання (на 1,3, 3,7 і 6,3% відповідно) і зменшував тривалість тіопенталового сну (12,5, 27,6 і 60,9% відповідно). Таким чином, досліджувані БАР дозозалежно впливали на фармакологічний сон, викликаний тіопенталом натрію, який має властивості ГАМК-міметика, що дозволяє припускати можливі механізми дії МІГУ-4, 5, 6.
При вивченні впливу БАР на швидкість формування і відтворення умовної реакції (УР) активного уникнення показано, що введення МІГУ-4, 5, 6 істотно не прискорювало навчання, а збільшення дози МІГУ-4 і 5 обумовлювало погіршення формування УР і прискорення її згасання в тесті активного уникнення. Цей ефект пов'язаний зі зміною сприйняття і оцінки психотравмуючої ситуації і є одним з проявів транквілізуючої дії. Таким чином, можна вважати, що всі досліджувані БАР мають транквілізуючу активність. Разом з тим, МІГУ-5 істотно зменшував, порівняно з контролем, число поєднань УР і безумовного рефлексу через 24 год після вироблення рефлексу, що свідчить про поліпшення відтворення УР і короткострокової пам'яті.
Таким чином, оксіетилідендифосфонатогерманати мають адаптогенну, транквілізуючу і снотворну активність, виразність якої залежить від дози БАР та їхньої структури.
Вплив синтезованих БАР на експериментальні нейропатологічні синдроми.На моделі МЕС найбільш виразний дозозалежний протисудомний ефект мав МІГУ-5, який проявлявся зменшенням числа тварин з розвиненими тонічними судомами задніх кінцівок. ЕД50 МІГУ-5 у мишей і щурів, відповідно, становили 92,0 і 78,0 мг/кг. ЕД50 МІГУ-6 була дещо більшою – відповідно 164,0 і 191,0 мг/кг. МІГУ-4 не мав істотної протисудомної дії в умовах МЕС. Захисний індекс (співвідношення ТД50/ЕД50) для МІГУ-5 становив на мишах 1,7 і на щурах – 2,4; для МІГУ-6 – відповідно на мишах і щурах 1,9 і 1,0, і відповідав такому для вальпроєвої кислоти.
Результати досліджень ефектів нових БАР на генералізовану судомну активність різної природи свідчали про те, що МІГУ-4 не впливав на інтенсивність судом у різних умовах їхнього моделювання (табл. 1). МІГУ-5 мав ефективну протисудомну дію, що полягала у зменшенні числа тварин з розвиненими клоніко-тонічними судомами на моделях судом, індукованих ПТЗ і NMDA. Водночас МІГУ-5 не виявляв помітної протисудомної дії в умовах моделей судом, викликаних за допомогою блокаторів ГАМК-ергічної передачі (пікротоксин і бікукулін) або антагоніста гліцинових рецепторів – стрихніну (див. табл. 1). МІГУ-6 мав протисудомні ефекти на моделях ПТЗ- і NMDA-викликаних судом. При цьому його ЕД50 була більшою, ніж для МІГУ-5. Таким чином, виразність протисудомних ефектів цих БАР залежить від природи судомної активності.
Таблиця 1. Вплив БАР і стандартних протиепілептичних препаратів на хімічно-викликані судомні реакції у мишей
| Сполуки і препарати | ЕД50 (мг/кг) в умовах застосування різних конвульсантів: | ||||
| ПТЗ, 85 мг/кг | ПКТ, 2,7 мг/кг | БКК, 2,5 мг/кг | Стрихнін, 1,2 мг/кг | NMDA, 0,2 нг/5 мкл | |
| МІГУ-4 | > 200,0 | > 300,0 | > 300,0 | > 200,0 | > 100,0 |
| МІГУ-5 | 64,9(52,3ч76,8) | > 300,0 | > 300,0 | > 200,0 | 48,1(36,2ч51,4) |
| МІГУ-6 | 182,0(176,0ч211,0) | > 200,0 | > 300,0 | > 300,0 | 82,8(56,5ч118,0) |
| Фенітоїн | > 50,0 | > 60,0 | > 60,0 | > 60,0 | 0,6(0,32ч0,95) |
| Карбамазепін | > 50,0 | 28,9(24,0ч41,6) | > 60,0 | > 60,0 | 3,1(2,6ч3,8) |
| Вальпроєва кислота | 209,0(175,0ч248,0) | 311,0(201,0ч439,0) | 437,0(369,0ч563,0) | 345,0(307,0ч392,0) | 83,4(57,8ч116,0) |
| Левітирацетам | > 540,0 | > 500,0 | > 500,0 | > 500,0 | > 500,0 |
При вивченні ефектів нових БАР на моделі аудіогенних судом у мишей МІГУ-5 значно зменшував виразність судом (знижуючи до 2,5 балів) у дозах 20-80 мг/кг. Середньоефективна доза пригнічення клонічних судом становила 62 мг/кг. МІГУ-4 і МІГУ-6 не проявляли істотного впливу в умовах цієї моделі судомної активності.