Бактеріологічне дослідження проводилось з метою виділення чистих культур мікроорганізмів і їх ідентифікації у відповідності із загальноприйнятими мікробіологічними методиками, відповідно визначнику бактерій Берджі (1994).
При проведені бактеріологічного дослідження ураховували: 1) загальну кількість мікроорганізмів; 2) стрептококи; 3) стафілококи; 4) дріжджеподібні гриби; 5) лактобактерії; 6) P. gingivalis; 7) A. actinomicetemcommitans; 8) P. intermedia.
Для швидкої і точної ідентифікації P. intermedia, P. gingivalis і A. actinomicetemcommitansзастосовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) з використанням ДНК-зондів і зворотної ДНК-гібридизації з генетичними маркерами перелічених видів (тест-система Micro-Dent®, Німеччина). Перевагою даною методики є не тільки висока специфічність і швидкість одержаних результатів (декілька годин), а й відсутність необхідності застосування живих мікробів.
Для визначення чутливості основних мікроорганізмів пародонтальної кишені до антибактеріальних препаратів застосовували метод паперових дисків і метод дифузії в агар на живильне середовище.
Біологічними субстратами для імунологічних досліджень була слина та сироватка крові, які отримували натщесерце до проведення гігієнічних заходів порожнини рота.
У периферичній крові проводилось вивчення показників клітинного імунітету: визначення кількості імунокомпетентних клітин Т-лімфоцитів (СД3+), їх головних імунокореляторних субпопуляцій Т-хелперів (СД4+) і Т-супресорів (СД8+), відносну кількість В-лімфоцитів (СД20+), NK- клітин (СД16+) експрес-методом з використанням комплементзв’язуючих МкАТ („Сорбент”, Москва, Росія) (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1996).
Імунорегуляторний індекс обчислювали за відношенням Т-хелпери (%) до Т-супресорів (%).
Експресію адгезивних молекул, що забезпечують адгезію нейтрофілів і моноцитів до ендотеліальних клітин визначали за допомогою МкАТ до СД54+ і СД116+, готовність клітин до апоптозу за допомогою МкАТ СД95+ - клітин (експресуючих FAS-антитіл).
Функціональну активність клітинної ланки імунітету оцінювали за кількістю клітин, експресуючих на поверхні рецептор до ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, б-фактору некрозу пухлини (б-ФНП) визначали у венозній крові хворих імуноферментним методом з використанням тест-систем (ООО „Протеиновый контур”, „Цитокин”, Санкт-Петербург, Росія) за інструкцією виробника. В якості нормативних даних були використані дані, представлені розробниками тест-систем. Результати імуноферментного аналізу реєструвались на біохімічному аналізаторі „Humma-Laser-2000” (Німеччина).
Фагоцитарну активність нейтрофілів крові визначали з застосуванням живої культури Staphyl. aureus. Встановлювали відсоток фагоцитарних клітин, фагоцитарне число і фагоцитарний індекс (Маянский А.М., Маянский Д.М., 1989).
Гуморальну ланку імунітету оцінювали за відносним і абсолютним вмістом В-лімфоцитів (СД20+ - клітин) у венозній крові, концентрації SIgA та імуноглобулінів G і M у змішаній нестимульованій слині методом радіальної імунодифузії в гелі (ManchiniG., 1965), а також за сироватковим рівнем низькомолекулярних імунних комплексів (Хаитов Р.М. и соавт., 1995).
Вміст загального ХС і тригліцеридів в сироватці крові визначали ферментним методом за допомогою комбінованих діагностичних наборів фірми „Human” (Німеччина).
Вміст ХС ЛПВЩ у сироватці крові визначали так, як і загальний ХС у супернатанті після осадження із сироватки апоВ-вміщуючих атерогенних ліпопротеїнів (ЛПНЩ і ЛПДНЩ) сумішшю 12 mM фосфовольфрамату натрію і 0,5 mMMgCl2 (1,1 mM фосфовольфрамату натрію і mMMgCl2 кінцевої концентрації).
Рівень ХС ЛПНЩ у сироватці крові обчислювали за формулою Friedwald еt.al: (1991) ХС ЛПНЩ = ХС – (ТГ: 5 + ХС ЛПВЩ). Дослідження ліпідного спектру сироватки крові проводили сумісно з лікарями-лаборантами Центральної науково-дослідної лабораторії Дніпропетровської державної медичної академії (завідувач – д.мед.н., професор О.Л.Дроздов).
Концентрацію глюкози в сироватці крові натщесерце і через 120 хвилин після прийому пробного сніданку (енергетичного еквіваленту 75г глюкози) визначали глюкозооксидазним методом по кінцевій точці на автоаналізаторі „Humma-Laser-2000” (Німеччина), за допомогою діагностичних наборів Діаком Глюкоза ГО 200 (ЗАО „Диаком ВНЦМДЛ”, Москва, Росія) (Дедов И.И., Фадеев В.В., 1998).
Рівень імунореактивного інсуліну в сироватці крові визначали натщесерце і через 120 хвилин після прийому пробного сніданку за допомогою стандартних радіо- імунологічних наборів (Інститут біохімії АН Білорусі „Рио-Инс-ПГ-125”).
Визначення концентрації глікозованого гемоглобіну проводилось методом афінної хроматографії високого тиску на автоматичному аналізаторі для визначення глікозованого гемоглобіну за допомогою наборів фірми „Human” (Німеччина).
Показники кальцій-фосфатного обміну оцінювали за концентрацією кальцію і неорганічного фосфору в сироватці ясенної крові, а також за рівнем їх екскреції в ранковій порції сечі, натщесерце, по відношенню до екскреції креатинину в цій же порції сечі.
Стан формування кісткової тканини оцінювали за активністю лужної фосфатази і за вмістом остеокальцина в сироватці капілярної крові. Визначення перелічених показників (крім остеокальцину), проводилось фотометричним методом наборами фірми „HoospitenDiagnostics” (Швейцарія) на біохімічному аналізаторі „Humma-Laser-2000” (Німеччина). Остеокальцин визначався радіоімунологічним методом з використанням наборів фірми „CisInternational” (Франція). Висновки щодо рівня резорбції кісткової тканини ми робили за вмістом оксипроліну в сечі і його екскреції по відношенню екскреції креатинину. Оксипролін визначався за реакцією з парадіметиламінобензальдегідом (Криль А.А., Фурцева Л.Н., 1968).
Результати дослідження підлягали статистичній обробці на Р-IVвMSExcel для операційної системи „Windows2000” з використанням критеріюt Стьюдента.
Результати власних досліджень та їх обговорення. Клінічні аспекти вивчення генералізованого пародонтиту у хворих на цукровий діабет 2 типу, залишаються актуальними. Перш за все, це відноситься до розробки питань оцінки перебігу захворювання, а також з’ясуванню етіологічних факторів і механізмів формування різного клінічного прояву запально-деструктивного процесу в пародонті.
За результатами нашого дослідження, генералізований пародонтит у хворих на цукровий діабет 2 типу проявляється двома варіантами: латентним перебігом та прогресуючим.
Отримані клінічні дані свідчили про те, що особливості генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу не мають прямої залежності від тривалості перебігу основного захворювання, а визначаються, багато в чому, його тяжкістю. Так, за клінічними і параклінічними показниками латентний перебіг генералізованого пародонтиту діагностувався у більшості пацієнтів з компенсованою формою цукрового діабету 2 типу (96,2% випадків). Напроти, при декомпенсованому перебігу цукрового діабету 2 типу превалювала частота виявлення прогресуючого генералізованого пародонтиту (80,8% випадків). З приблизно однаковою частотою зустрічались обидва типи перебігу захворювання при субкомпенсованій формі основного захворювання (відповідно у 43,8% і у 56,2% випадках).
Дані обставини потребували проведення багатопланових клініко-лабораторних досліджень, направлених на з’ясування того, які етіологічні фактори і конкретні патогенетичні механізми у хворих на цукровий діабет 2 типу визначають формування різних варіантів клінічного прояву генералізованого пародонтиту.
Враховуючи вищезазначене, нами був проведений мікробіологічний моніторинг пародонтальної еконіші у 178 хворих на генералізований пародонтит, із них у 152 пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу і 26 хворих без супутніх захворювань.
Встановлено, що у хворих з латентним перебігом генералізованого пародонтиту при цукровому діабеті 2 типу і у пацієнтів групи порівняння домінуюче значення мають мікроаерофільні бактерії на фоні зниження кількості лакто- і біфідобактерій. При цьому ідентифіковані наступні аеробні мікроорганізми: Peptostreptococcus (у 89,4%), Streptococcushaemoliticus (у 77,6%), Streptococcussangvius (у 53,9%), Staphylococcusaureus (у 38,2%), гриби роду Candida (у 29,8%), Streptococcusintermedia (у 28,9%), Fusobacteriumnecroform (у 11,8%).
Важливо відмітити, що частота зустрічаємості A. actinomicetemcommitans, Prevotellaintermedia, Bacteroidesforsithus у хворих на цукровий діабет 2 типу з латентним перебігом генералізованого пародонтиту не мала достовірної різниці в порівнянні з такою у пацієнтів без цукрового діабету і відповідно склала: 26,3%; 18,4% і 36,8% випадків. З усіх пародонтопатогенів у названих хворих найбільш частіше зустрічався Porhyromonasgingivalis – у 40,7% випадках.
В той же час, відмінною особливістю мікробного спектру тканин пародонту у хворих на прогресуючий генералізований пародонтит було домінуюче знаходження в тканинах пародонту аеро-анаеробних асоціацій мікроорганізмів, більшість із яких були 3-4 компонентними. Такий біоценоз у пародонтальних тканинах реєструвався у хворих даної групи в 4 рази частіше, ніж у хворих з латентним перебігом на фоні зникнення індигенної флори. Крім цього, аеробні і анаеробні мікроорганізми пародонтальної еконіші у хворих з прогресуючим генералізованим пародонтитом при цукровому діабеті 2 типу володіли високою здатністю до обсіменіння, мали не нижче 106 і 107 КОЕ од/мл.
У хворих з прогресуючим перебігом захворювання нами знайдена висока частота виявлення умовно-патогенних мікроорганізмів із пародонтальної кишені: Streptococcussangvius - у 71,1% випадках, Peptostreptococcusmicros - у 64,5% випадках, Enterobacterspp. – у 55,3% випадках, Streptococcusintermedia - у 44,7% випадках. Більш ніж у 25% випадках, у пацієнтів, які страждають на цукровий діабет 2 типу з прогресуючим типом перебігу генералізованого пародонтиту, виявлені клебсієли.
Виявлені у великій кількості (у 51,3% випадках) Candidaalbicans є показником вираженого дисбіотичного стану пародонту.