Получение большинства природных антибиотиков основано на биосинтезе, осуществляемом в клетке микроорганизма. Микробная клетка выполняет роль сложнейшей химической лаборатории, в которой происходят очень тонкие процессы, недоступные пока для органического синтеза, причем для их проведения не требуется высоких температур, повышенного давления, катализаторов.
Получение антибиотиков с помощью микробиологического синтеза включает такие основные этапы, как изыскание высокопроизводительных штаммов продуцентов, подбор питательных сред, процесс ферментации, выделение и очистка антибиотика.
Биосинтез выполняют в специальных аппаратах — ферментерах — вместимостью в несколько десятков тысяч литров. Ферментацию проводят «глубинным способом», который заключается в том, что рост плесени и образование антибиотика происходят по всей толще ферментационной массы. Каждый из микроорганизмов требует специальных условий ферментации: температуры, подачи воздуха (аэрации), определенной продолжительности процесса. Для обеспечения жизнедеятельности микроорганизма и максимального накопления антибиотика необходимы специальные питательные среды. Регулируя качественный и количественный состав ингредиентов питательных сред, можно существенно влиять на выход антибиотика. Питательные среды вначале подают в посевные аппараты (через установки непрерывной стерилизации). Здесь происходит выращивание культур. Затем смесь культуры и питательной среды перемещают в ферментер, где происходит процесс биосинтеза. В ферментер добавляют также пеногасители во избежание образования пены при аэрации.
Антибиотики выделяют из культуральной жидкости осаждением, с помощью адсорбционной или ионообменной хроматографии, экстракцией различными органическими растворителями или при различных значенияхсреды. Очистку антибиотика-сырца осуществляют хроматографическим методом или противоточной экстракцией с последующей перекристаллизацией. Выделенный кристаллический антибиотик подвергают тщательному химическому и биологическому контролю. Весь процесс производства антибиотиков осуществляют в строго соблюдаемых асептических условиях.
4.4 Методы анализа антибиотиков
Количественное определение большинства антибиотиков осуществляют биологическим методом, основанным на сравнительной оценке угнетения роста тест-микроорганизмов. Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами. ГФ XI рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образцов антибиотика на тест-микроорганизм (ГФ XI, в. 2, с. 210).
Это испытание основано на способности антибиотиков угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов испытуемым препаратом и Государственным стандартным образцом (ГСО) антибиотика. Активность ГСО устанавливают, как правило, в соответствии с Международными биологическими или химическими стандартами.
Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации. Процесс инкубации осуществляют в течение 16-18 ч при 36-38°С.
Расчет биологической активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на основании результатов определения пяти концентраций стандартного препарата. Умножением полученной концентрации (ЕД/мл) на степень разведения вычисляют активность (содержание ЕД) антибиотика в 1 мг препарата. Точность определений колеблется от 5 до 25%.
Единица действия (ЕД) представляет собой меру, которой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды. Количественное выражение 1 ЕД отличается у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого вещества, а у стрептомицина основания, тетрациклина и его производных 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого вещества.
В последние годы разработаны ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических жидкостях.
Для установления концентрации антибиотиков аминогликозидов в крови больных применяют более простой модифицированный метод диффузии в агар. Ускорение определения до 2-6 ч вместо 16-18 ч достигается за счет создания максимально благоприятных условий для роста тест-микроорганизмов (уменьшения слоя питательной среды, оптимизации температуры инкубации и т.д.).
К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов. Концентрацию определяют сравнением изменений рН в средах испытуемых и стандартных образцов через 1,5 ч после начала инкубации. На этом принципе основан так называемый уреазный метод, заключающийся в наблюдении за изменением рН жидкой питательной среды, содержащей 2% мочевины. Выделяющийся в процессе роста микроорганизма аммиак вызывает изменение рН среды. Точность определений около 46%.
Ферментативный метод основан на инактивации аминогликозидов в крови специфическими ферментами (аденилтрансфераза и ацетилтрансфераза), продуцируемыми грамотрицательными микроорганизмами, устойчивыми к антибиотикам этой группы. Эти ферменты катализируют процесс аденилирования или ацетилирования аминогликозидов в присутствии 14С-аденозинтрифосфата или 14С-ацетилкоэнзима А. Они являются источником радиоактивности. Затем способом подсчета радиоактивности делают заключение о концентрации антибиотика. Определение занимает 1-2 ч.
Радиоиммунный метод основан на сравнительной оценке конкуренции антибиотика, меченного тритием, и испытуемого антибиотика по отношению к специфическим антителам иммунной сыворотки. Метод отличается очень высокой чувствительностью (0,003-0,01 мкг/мл), результаты получают в течение 1-2 ч, точность высокая (коэффициент вариации 4-5%).
На точность биологических методов оказывают влияние целый ряд факторов (характер питательной среды, условия инкубации, точность измерения зон угнетения роста и т.д.). Поэтому понятно стремление исследователей к замене биологических методов контроля химическими и физико-химическими. При этом обязательно должна соблюдаться адекватность предлагаемых методик по отношению к результатам биологического контроля.
Использование различных химических и физико-химических методов рассмотрено далее на примерах испытаний на подлинность и количественного определения ЛВ, относящихся к числу антибиотиков и их полусинтетических аналогов.