Способи використані племпідприємствами для визначення якості та запліднюючої здатності сперми бугаїв, акапацитації сперміїв йвисокоефективне середовище вирощування ембріонів іn vitro–для наукових досліджень та практичних робіт з отримання ембріонів великої рогатої худоби поза організмом.
Основні положення дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Сумського національного аграрного університету,
Харківської державної зооветеринарної академії Міністерства аграрної політики України, Львівського національного університету імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено науково-дослідну програму, проведено експериментальні дослідження, аналіз першоджерел літератури, розроблено теоретичне обґрунтування з відбору та оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, механізмів капацитації сперміїв, оогенезу та ембріогенезу в корів, зроблені фотографії сперміїв, ооцитів і ембріонів, відзняті процеси капацитації сперміїв, запліднення і розвитку ембріонів корів. Проведено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему й методичні підходи проведення досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і результатів досліджень апробовані і схвалені на міжнародних та республіканських науково-практичних конференціях і з’їздах: “Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченої 35-річчю Інституту фізіології і біохімії тварин та 95 -річчю від дня народження засновника інституту, академіка УА СГН, заслуженого діяча науки України, професора Ґжицького С. З.” (Львів, 1995), “Актуальні проблеми розвитку сучасної зооветеринарної науки”, (Львів, 2001), “Здобутки і перспективи ветеринарного акушерства” (Львів, 2002), “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, 2003), “Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2006), “Тваринництво XXI сторіччя: новітні технології, досягнення та перспективи” (Харків, 2006), “Механізми функціонування фізіологічних систем (Львів, 2006), “Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку” (Харків, 2008).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 наукових праць, з яких 30 статей, СОУ 1.42-37-6171 : 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”, методичні рекомендації, 9 публікацій у матеріалах конференцій та отримано 4 патенти на винахід.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, висновків і практичних пропозицій, додатків, списку джерел літератури, який включає 867 назв, з них 756 іноземних. Текст викладений на 359 сторінках комп’ютерного варіанту, включає 17 рисунків і 72 таблиці.
Умовні позначення: СС – суспензія сперміїв; СМ – слизова матки корови; СК – суспензія клітин; БСА – альбумін сироватки крові бугая; ФР – фолікулярна рідина; ГП – гепарин; АМП – амідопірин; т-БГП – т-бутилгідроперекис; МДА – малоновий діальдигід; Г-SH – відновлена форма глутатіону; АА – аскорбінова кислота; ММ – молекулярна маса.
Основний зміст роботи
Огляд літератури складається з 5 розділів у яких наведені дані з характеристики фізіологічних показників та інтенсивності окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв та фолікулах яєчників корів, сперміях і ооцитах при підготовці і використанні їх у штучному осіменінні та репродуктивній біотехнології, впливу природних антиоксидантів та умов культивування на запліднюючу здатність сперміїв, запліднення ооцитів і розвиток ембріонів.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження виконано протягом 1994–2005 років в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН, Львівському, Сокальському, Судово-Вишнянському, Дрогобицькому племпідприємствах, м’ясопереробних підприємствах: „Прикарпаття” та „Галев-Ресурс”.
Досліджували, отриману на штучну вагіну, сперму 72 бугаїв у віці 2–9 років (порід: української чорно-рябої молочної, німецької, голландської, голштинської чорно-рябої, британо-фризької) систематично з інтервалом 10–14 днів. Визначали у свіжоотриманих еякулятах – об’єм (мл), рухливість сперміїв (активність, бали), концентрацію (109 клітин/мл) та кількість живих (%; Яблонський В. А., 1962), виживання при температурі + 46,5°С (хв; Рослановський П., 1962) після розбавлення 1 : 10 розріджувачем для заморожування сперми в облицьованих гранулах; резистентність (тис; Смирнов І. В. , 1976); у розмороженій спермі – виживання сперміїв (хв) при температурі +38,0°С. Спермії з придатка сім’яника отримували після забою бугаїв у віці 10–8 міс через надріз стінки каналу придатка з наступним вимиванням 2,8%-ним розчином натрію цитрату чи 0,9%-ним натрію хлориду. У суспензії сперміїв (СС) визначали концентрацію (109 клітин/мл) підрахунком у камері Горяєва, рухливість – візуально, під мікроскопом, активність СДГ (мкМ/хв/л; Чухрій Б. М. та ін., 1995), цитохромоксидази (ЦХО; мкМ/хв/л; Чухрій Б. М., Клевець Л.О., 1978); вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення (дегідроаскорбінову і дикетогулонову кислоти; мкг/мл; Климов А. М., 1956), дихальну активність – полярографічно (нг-атом О/0,1мл СС/хв); відновну здатність – потенціометрично (фериціанід калію – 10-4М; мкг перетвореного К3[Fe(СN)6] (мкг К3...)/0,1мл СС/хв; Штольц К.Ф. та ін., 1980). Інтенсивність дихання та відновну здатність сперміїв досліджували при температурі +38,5°C у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ; NaCl–0,8г, KCl–0,02г, Na2HPO4–0,11г, KH2PO4–0,02г, MgCl2–0,01г, Н2О до 100 мл). Для вивчення окисно – відновних процесів у статевих клітинах бугаїв та впливу чинників капацитації отриману з придатка сім’яника СС, оцінених за рухливістю, зберігали 6–8 год при температурі 0 – +4°С з наступним інкубуванням 30, 60 і 120 хв (температура +38,5°С) у середовищах капацитації: контрольному – ФСБ та дослідних – ФСБ з додаванням: гомогенату слизової матки корови (СМ; яєчник зі ”свіжою овуляцією” – на місці фолікула утворився згусток крові); фолікулярної рідини (ФР; не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см, 20% концентрація у пробі); гепарину (ГП, 200 од/мл); 0,1% розчину БСА зі 150 мМ натрію хлориду; амідопірину (АМП, 4Ч10-3М); перекису водню (Н2О2; 1%-ний розчин). Досліджували: стан акросоми сперміїв (GrossN.L., MeizelS., 1989), інтенсивність поглинання кисню та відновну активність без- та за наявності інгібіторів. Використані інгібітори: гліколізу – натрій фторид (NaF; 10–3M); ланцюга дихання мітохондрій: НАД-залежної ланки – амітал (АМ; 5Ч10-3М) і термінальної (цитохромоксидази) – натрію азид (NаN3; 5Ч10–2M). Вільнорадикальне окиснення ненасичених жирних кислот, яке супроводжується споживанням кисню, інгібували NаЕДТА (6Ч10-4М; Орехович В.Н., 1977). При цьому, різницю між споживанням кисню чи відновною активністю до- та після додавання інгібітора вважали часткою біохімічного процесу, відповідно, у реалізації кисню та постачанні відновних еквівалентів у позаклітинний простір. Енергетичні потреби сперміїв забезпечували фруктозою (20мМ), піруватом, сукцинатом, глутаматом, a-кетоглутаратом (б–КГ), малатом (по 10-2М). Активність Г-6-ФДГ ( мкМ НАДФН /мл/хв; Farnararo M. etal., 1978, GruceanuA., BucsaL., 1979 ) та СДГ визначали за наявності фолікулярної рідини та гепарину, після інкубації 120 хв при +38°С. Спектр білків у процесі виживання сперміїв (при температурі +46,5°С) і після зберігання (при температурі 0 – +4°С) вивчали електрофорезом у поліакриламідному гелі (ПААГ; 7,5% та 12,5% з 0,1%-ним вмістом натрію додецилсульфату) у еякулятах та СС. Ідентифікували окремі білки за допомогою відповідних маркерів з молекулярними масами (ММ): 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа (LMW; Pharmacia, Швеція).
Вплив антиоксидантів на окисно-відновні процеси в еякулятах, вивчали у ФСБ при додаванні глутатіону (відновлена форма, Г-SH; 3Ч10-3М) і аскорбінової кислоти (АА; 5Ч10-3М) та моделюванні ”окисного навантаження” (т- бутилгідроперекис; т-БГП, 10-3М) за наявності субстратів: фруктози, пірувату, б-КГ, сукцинату і лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача сперми (ЛЖГ-cредовище) на дихальну та відновну активності сперміїв без- та з використанням інгібіторів. Вплив Г-SH і АА вивчали в еякуляті розділеному на частини – контрольну (ЛЖГ- cередовище) і дослідні – ЛЖГ-cередовище з додаванням: АА (2,50; 5,0; 10,0 мМ); Г-SH (2,50; 5,0; 10,0 мМ) та поєднання АА+Г-SH (1,25+1,25; 1,25+2,5; 2,50+2,50; 5,0+5,0 та 10,0+10,0 мМ). Досліджували у свіжоотриманій і розмороженій спермі інтенсивність поглинання кисню і відновну здатність, активність СДГ і ЦХО, вміст малонового діальдигіду (МДА; TappelA. L., ZalkinH., 1959), рухливість, виживання і резистентність статевих клітин. Для штучного осіменіння корів використовували сперму бугаїв Контакта 1375 і Ринка 2919. Кожен еякулят розділяли на дві частини, контрольну (без антиоксидантів) і дослідну (з антиоксидантами). Ефективність доданих антиоксидантів у розріджувачі визначали обліком результатів штучного осіменіння корів-аналогів.
Відбір яєчників корів за ооцитпродуктивністю, вивчення окисних процесів у фолікулах та ооцитах проводили після оцінювання їх фізіологічного стану: “фолікулярного зростання”, без жовтого тіла; зі ”свіжою” овуляцією, на місці фолікула утворена порожнина, жовте тіло відсутнє або діаметром до 0,5см, червоного кольору; з “раннім” жовтим тілом, діаметром 1,0–2,0см, червоного або брунатного кольору; з “пізнім” жовтим тілом, діаметром 0,5–1,5см, жовтого кольору. Для досліджень використовували яєчники корів з фолікулами діаметром до 4мм (малі), 4–7мм (середні) і більше 7мм (великі).