Антральну рідину (фолікулярна рідина + клітини гранульозного шару фолікулів + ооцити), отримували методом аспірації фолікулів. У ній визначали кількість клітин гранульозного шару – підрахунком в камері Горяєва (106 клітин/мл) та ооцитів – оцінювали стан кумулюсу (без кумулюсу – “голі”; з розпушеним або частково втраченим; з компактним багатошаровим) і поміщали в чашки Петрі з середовищем культивування. В антральній рідині фолікулів вивчали активність Г-6-ФДГ, вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення її і глутатіону (мг%; Чулкова М. С., 1955). Для вивчення локалізації антиоксидантів антральну рідину ділили на частини – в одній визначали їх вміст, іншу центрифугували при 600 g 15 хв, супернатант відділяли, а осад суспендували в адекватному об’ємі 0,9 %-ного натрію хлориду. Процедуру повторювали двічі. Антиоксиданти визначали у супернатанті (фолікулярній рідині) та суспендованому осаді (клітинах гранульозного шару фолікулів). Крім цього, у фолікулярній рідині вивчали вміст загального білка (г%) біуретовою реакцією, фракції білків елекрофорезом в 7,5% ПААГ (%) та глікопротеїнів (%; реактивом Шиффа). Клітини гранульозного шару фолікулів суспендували в середовищі RPMI-1640 (Flow Laboratories) і вивчали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/0,1мл суспензії клітин (СК)/хв); відновну активність (мкг К3…/мл СК/хв) без- та з інгібіторами. НАДН-редуктазні процеси стимулювали НАДН (10-3М), вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).
Для дозрівання ооцити інкубували в чашках Петрі з середовищами культивування клітин: ТС 199, Іґла (Sigma), RPMI-1640. До середовищ додавали: 10% фолікулярної рідини (не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см), 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки крові корів, клітини гранульози (5–7Ч106/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Ооцити культивували в герметично закритому ексикаторі 16–18 год за максимальної вологості, вмісту СО2 5,0% і температури 38,5°С, рН середовища 7,2–7,4.
Запліднювали ооцити in vitro сперміями з придатка сім’яника, після капацитації у фолікулярній рідині (0,1мл СС; 12,0–15,0Ч106 /мл з активним прямолінійним рухом), які вносили в чашки Петрі до ооцитів проінкубованих 16–18 год.
Для вивчення інтенсивності окисних процесів у ембріонах, після 16–18 год спільного культивування ооцитів зі сперміями, ембріони переносили в середовища культивування: ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які додатково містили 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогів матки корів. Культивували в герметично закритому ексикаторі при максимальній вологості, температурі 38,5°С, 5% СО2. Середовище замінювали через кожні 48 год культивування.
У свіжоотриманих і збережених (24 год) ооцитах, визначали інтенсивність поглинання кисню (нг-атом О/ооцит/хв) та відновну активність (пкг К3.../ооцит/хв) при використанні субстратів – ендогенних (ФСБ Дюльбеко) і екзогенних: сукцинату (10-2М), АТФ (5Ч10-6М), середовищ культивування клітин (ТС 199, Іґла, RPMI-1640). Для виявлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню за наявності ендо- та екзогенних субстратів використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10-3М); НАДН-залежної ділянки дихального ланцюга (амітал; 5Ч10-3М); термінальної (NaN3; 5Ч10-2М); вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).
У ембріонів різних стадій розвитку визначали дихальну і відновну активність у середовищах – ФСБ Дюльбеко і RPMI-1640. Для встановлення залежності між інтенсивністю поглинання кисню, зовнішньоклітинним транспортом електронів та часткою ланок дихального ланцюга в реалізації кисню використовували інгібітори: гліколізу (NaF; 10-3М); НАДН-залежної (амітал; 5Ч10-3М) та термінальної (натрію азид; 5Ч10-2М) ділянок дихального ланцюга, вільнорадикальне окиснення жирних кислот гальмували NaEДTA (6Ч10-4М).
Матеріал документували мікрофотографіями.Статистичний аналіз отриманих результатів проведено за Плохінським М. О. (1969) з використанням комп’ютера та розроблених програм (програмне забезпечення Clipper).
Результати Власних досліджень та їх аналіз
Інтенсивність окисно-відновних процесів у спермі бугаїв
Сперма бугаїв характеризується високою інтенсивністю окисно-відновних процесів. Так, дихальна активність сперміїв становить 17,8±0,55 нг-атом О/108сперміїв/хв, швидкість відновлення калію фериціаніду – 8,6±0,97 мкг К3…/108сперміїв/хв, активність СДГ – 11,2±0,21 і ЦХО – 33,1±0,37 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти – 37,3±3,51 мкг/мл, окиснених продуктів – 10,7±1,08 мкг/мл, загальний вміст 47,7±3,31 мкг/мл; відношення окремих складових до загального вмісту, відповідно, 78,2 : 22,4 (табл. 1). Вміст альбуміну 16,9±1,00%, глобулінів: a- 30,6±2,17%, b- 15,7±0,93%, g- 30,6±1,55%. При високих середніх значеннях, встановлено значні коливання величин досліджених біохімічних показників. Так, коефіцієнт варіації споживання кисню і аскорбінової кислоти та їх компонент становить більше 50%, активності ферментів від 30 до 50%, відновної здатності – 20,9%.
Таблиця 1
Характеристика біохімічних показників еякулятів бугаїв
| Досліджувані показники | n | M ± m | CV | lim | |
| Споживання кисню, нг-атом О/ 108 сперміїв / хв: спермою | 187 | 17,8 ± 0,55 | 59,1 | 5,3 – 60,7 | |
| в тому числі: мітохондріальне | 187 | 9,4 ± 0,39 | 55,8 | 4,1 – 32,8 | |
| азидрезистентне | 186 | 10,9 ± 0,56 | 70,1 | 1,3 – 27,2 | |
| Відновна активність, мкг К3…/108 сперміїв/хв | 118 | 8,6 ± 0,97 | 20,9 | 0,1 – 26,0 | |
| Активність СДГ, мкМ/хв/л | 661 | 11,2 ± 0,21 | 48,5 | 0,5 – 55,0 | |
| Активність ЦХО, мкМ/хв/л | 678 | 33,1 ± 0,37 | 29,3 | 0,5 – 100,0 | |
| Вміст, мкг/мл: | аскорбінової кислоти | 280 | 37,3 ± 3,51 | 69,7 | 5,0 – 110,0 |
| окиснених продуктів (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот) | 280 | 10,7 ± 1,08 | 90,7 | 0,5 – 45,0 | |
| загальний (аскорбінової кислоти + окиснених продуктів) | 280 | 47,7 ± 3,31 | 52,6 | 5,0 – 150,0 | |
Фактори впливу на інтенсивність окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв
Мінливість наведених показників зумовлена зрілістюсперміїв в еякуляті, індивідуальними особливостями плідників, що залежить від генетичних факторів, відмінністю першого і другого еякулятів, отриманих у той самий день та різні. Спермії отримані з придатка сім’яника, порівняно з еякульованими, характеризуються нижчими значеннями споживання кисню на 73,2% та відновної здатності на 95,0%. Від загальної кількості спожитого кисню аеробний гліколіз займає у сперміях з придатка сім’яника 16,7%, еякульованих – 48,1%, активність НАД-залежної ланки дихального ланцюга, відповідно, 41,6% і 34,0% та термінальної (ЦХО) у перших – не змінюється, других – 8,0%.
За дихальною активністю різниця між першим і другим еякулятами становить 42,8%, її мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, відповідно, 71,5 і 24,6%, активністю СДГ і ЦХО – 82,0 і 77,8%, вмістом аскорбінової кислоти – 66,7%, продуктами окиснення не відрізняються, а за загальним вмістом – 40,0%. За фізіологічними показниками еякуляту різниця становить: об’ємом – 33,4%, концентрацією та кількістю живих сперміїв, відповідно, 44,5 та 19,1%.
При дослідженні сперми бугаїв у різні дні найбільша різниця виявлена за активністю СДГ та вмістом аскорбінової кислоти –100,0%, споживанням кисню, в тому числі, мітохондріальним та азидрезистентним – 58,6–61,0%, окисненими продуктами аскорбінової кислоти та активністю ЦХО – 50%. Коливання фізіологічних показників становлять: об’єму еякуляту 15,3–25,0%, концентрації сперміїв 25,0–80,0%, кількості живих 8,0–27,1%.
Різниця за індивідуальними особливостями бугаїв становить: споживання кисню сперміями у еякуляті – 42,0%, його мітохондріальною і азидрезистентною компонентами, відповідно, 38,7 і 46,0%, активності СДГ та ЦХО – 12,5 та 8,1%, вмісту аскорбінової кислоти – 67,8% (р<0,01), окиснених продуктів – 50,9% (р<0,05). За фізіологічними показниками еякулятів, а саме, об’ємом на 22,4%, концентрацією сперміїв – 7,8%, кількістю живих – 4,7%.
Біохімічні показники сперми змінюються в залежності від сезону року і, навесні проявляються низькі значення споживання кисню (нг-атом О/108 сперміїв/хв) 16,3±0,81, мітохондріального і азидрезистентного дихання – 7,6±0,48 і 8,7±0,46, активності СДГ 10,8±0,41, ЦХО 31,6±0,76 мкМ/хв/л. Влітку величини значень досліджуваних показників залишаються майже на тому ж рівні. Винятком є мітохондріальне дихання та активність СДГ, які збільшуються, відповідно, на 30,2% (р<0,05) та 9,2%. Восени підвищується споживання кисню спермою на 87,7% (р<0,001), в тому числі, мітохондріальне на 10,1% (р<0,001), азидрезистентне у 2,4 рази (р<0,001), активність ЦХО на 14,7% (р<0,001). Активність СДГ, порівняно з літнім періодом, не змінюється і становить 11,5±0,36 мкМ/хв/л. Взимку значення показників знижується, порівняно з осіннім періодом: споживання кисню спермою на 17,2% (р<0,01), азидрезистентне дихання на 28,1% (р<0,001), активність СДГ на 2,7%, ЦХО на 6,2% (р<0,05). Мітохондріальне дихання не змінюється і становить 11,0±0,76 нг-атом О/108сперміїв. Вміст аскорбінової кислоти взимку і навесні майже однаковий (37,0 мкг/мл), влітку знижується на 21,4%, а восени знову підвищується до 53,7±4,59 мкг/мл (на 84,5%). Вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот, низький взимку (11,2±1,04 мкг/мл), навесні і влітку збільшується на 13,4 і 26,8% (р<0,001), а восени досягає максимального значення – 20,9±1,11 мкг/мл. При цьому, відношення окремих складових у загальному вмісті аскорбінової кислоти свідчить про зниження частки аскорбінової кислоти від початку весни до літана 5,0% і зростання окиснених продуктів на 12,5% (р<0,05). Влітку вміст дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот зменшується на 10,5%, а аскорбінової кислоти підвищується на 3,8%. Восени відношення аскорбінова кислота : окиснені продукти у загальному вмісті становить 71,9±2,43 : 28,1±2,44% і майже таке ж взимку (77,1±3,75:22,9±3,72%). Із фізіологічних показників еякуляту з сезоном року змінюється об’єм, з низького восени (3,4±0,21мл), взимку підвищується на 24,5% (р<0,001) і навесні досягає максимального значення (5,0±0,16мл). Влітку величина показника знижується на 20,0% (р<0,001), порівняно із весняним періодом, проте вища, ніж восени на 15,0% (р<0,05). Концентрація сперміїв максимальна в осінній період (1,05±0,03Ч109/мл), зимою знижується на 8,6%, а весною і влітку – в межах 0,88–0,89Ч109/мл. Кількість живих сперміїв в еякуляті низька весною (65,9±0,81%), влітку збільшується на 7,1% (р<0,001), а восени та взимку поступово знижується, відповідно, на 3,0 та 3,7%.