Впливконцентрації сперміїв на споживання кисню середній за силою, але відрізняється за величиною і найвищий для азидрезистентного (h = 0,53), нижчий – дихальної активності сперми (h = 0,43) та мітохондріального дихання (h = 0,36). Збільшення кількості сперміїв у еякулятах супроводжується підвищенням немітохондріальних окисних процесів та гальмуванням АТФ-генеруючої здатності. Зокрема, аналіз активності ЦХО, величина якої позитивно корелює з концентрацією сперміїв (h = 0,60), засвідчив, що в еякулятах з максимальною кількістю статевих клітин (більше 1,40Ч109/мл) у перерахуванні на 109 сперміїв активність ферменту нижча у два рази, порівняно зі спермою середньої концентрації (0,81–1,00Ч109/мл). Така залежність пояснює зниження виживання сперміїв свіжоотриманих еякулятів у зв’язку з активністю ЦХО.
Кореляційним аналізом фізіологічних показників сперміїв у зв’язку з їх концентрацією в еякуляті встановлено найбільшу тривалість виживання у свіжоотриманій спермі (110,3–119,0 хв) при концентрації до 1,40Ч109/мл, розмороженій (312,0±7,32 хв) – при 0,60–1,00Ч109/мл. Висока резистентність сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (25,6–27,7 тис) проявляється за концентрації 0,60–1,40Ч109/мл.
Кількість живих сперміїв позитивно корелює з величиною азидрезистентного споживання кисню (h = 0,41; здатністю окиснювати субстрати) та обернено – з мітохондріальною компонентою (h = 0,24; підвищеною енергогенеруючою здатністю) і дихальною активністю сперми (h = 0,33). Оскільки кількість живих сперміїв позитивно корелює з відносним вмістом азидрезистентного споживання кисню (r = +0,83, коливання – r = +0,74–0,92), даний біохімічний показник слід використовувати для об’єктивного оцінювання якості свіжоотриманих еякулятів. Кількість живих сперміїв виявляє обернену кореляцію з вмістом альбуміну (h = 0,38) та позитивну з a-глобулінами (h = 0,33), а b- та g- глобуліни не змінюються і знаходяться в межах, відповідно, 15,6–16,1% і 29,9–32,8% (h = 0,13). Кількість живих сперміїв вірогідно впливає на виживання їх у свіжоотриманих еякулятах та резистентність, після розморожування сперми і при 60,0–80,0% названі показники становлять, відповідно, 116,1±3,04 хв і 12,0–13,0 тис.
З аналізу кореляцій між вказаними фізіологічними характеристиками еякуляту і вмістом аскорбінової кислоти та продуктів її окиснення (h = 0,05–0,19) випливає, що коливання наведених біохімічних показників залежить від інтенсивності окисних процесів у спермі, синтезу в організмі і нагромадження аскорбінової кислоти в спермі бугаїв.
Антиоксиданти у складі розріджувача сперми бугаїв, якість та запліднююча здатність сперміїв
Дослідженнями встановлено, що аскорбінова кислота і глутатіон позитивно впливають на життєздатність сперміїв. Так, додавання АА і Г-SH до розріджених еякулятів бугаїв збільшує кількість живих сперміїв протягом 30 хв інкубування і підвищує тривалість виживання. Висока збереженість сперміїв (33,2–47,8%) проявляється при внесенні 2,50 мМ АА або Г-SH і їх поєднанні – 1,25+1,25; 1,25+2,50; 2,50+2,50 мМ (рис. 2). У свіжоотриманій спермі високе виживання
Активність ферментів дихання і інтенсивність споживання кисню сперміями бугаїв за дії антиоксидантів. Дослідженням інтенсивності дихання статевих клітин і активності окисних ферментів виявлено, що зі збільшенням доз Г-SH (1,25; 2,50; 5,00 мМ), підвищується споживання кисню до 30,4–47,9 нг-атом О/108сперміїв/хв (р<0,001; табл. 2). При цьому, стимулюється активність СДГ,яка при 1,25 мМ зростає на 75,6%, 2,50 мМ – на 129,7% і при 5,00 мМ – на 168,9%, а ЦХО – знижується при вказаних дозах, відповідно, на 4,9, 21,9 і 48,7%.
Таблиця 2
Інтенсивність окисно-відновних процесів у розбавленій спермі з антиоксидантами
| Частиниеякуляту | Вміст доданих речовин, мМ | Поглинання кисню, нг-атом О/ 108сперміїв/хв | Активність ферментів, мкМ/хв/л | ||||
| СДГ | ЦХО | ||||||
| n | M ± m | n | M ± m | n | M ± m | ||
| Контрольна | - | 14 | 20,6±2,86 | 10 | 7,4±0,89 | 10 | 29,6±1,95 |
| Дослідні:аскорбіновакислота (АА) | 1,25 | 14 | 27,6±2,66 | 10 | 8,3±0,63 | 10 | 39,5±2,73* |
| 2,50 | 14 | 24,2±3,35 | 10 | 7,7±0,92 | 10 | 39,2±2,96* | |
| 5,00 | 14 | 21,9±0,94 | 10 | 6,2±0,87 | 10 | 35,9±3,18 | |
| відновленаформа глута- тіону (Г-SH) | 1,25 | 14 | 30,4±2,64* | 10 | 13,0±0,56*** | 10 | 28,2±2,20 |
| 2,50 | 14 | 47,9±5,91*** | 10 | 17,0±0,40*** | 10 | 21,6±2,63* | |
| 5,00 | 14 | 45,5±3,40*** | 10 | 19,9±1,11*** | 10 | 15,2±1,83*** | |
| АА + Г-SH | 1,25 + 2,50 | 14 | 28,7±3,15 | 10 | 16,2±0,79*** | 10 | 2,5±0,56*** |
Дія аскорбінової кислоти також залежить від внесеної дози. Мінімальний вміст її (1,25мМ) стимулює дихання на 40,0%, підвищує активність СДГ і ЦХО, відповідно, на 12,1 і 33,4%. Підвищення вмісту (більше 2,50 мМ) знижує інтенсивність дихання, порівняно з максимальним значенням, на 14,0–26,0%, активність СДГ на 7,8–33,8% і ЦХО на 0,7–10,0%. Поєднання обох компонентів (АА+Г-SH – 1,25+2,50 мМ) підвищує поглинання кисню на 39,3%, активність СДГ на 118,9% і знижує ЦХО майже в 12 разів.
Аналогічні зміни СДГ і ЦХО за дії антиоксидантів виявлені при вивченні активності ферментів у розмороженій спермі.
Позитивний вплив антиоксидантів у розріджувачі еякулятів зумовлений здатністю Г-SH шунтувати потік електронів як з НАД-залежної, так і кінцевої ланок дихального ланцюга (ЦХО) і забезпечувати альтернативні шляхи їх утилізації (рис. 4). АА, після інгібування дихальної активності сперміїв аміталом, повністю відновлює споживання кисню (до інгібування – 58,7±12,74 нг-атом О/108 сперміїв/хв, при максимальній дозі – (5,00 мМ) – 60,7±9,93 нг-атом О/108 сперміїв/хв).
Додавання вказаного антиоксиданта в наростаючих дозах, на фоні дії азида, знижує інтенсивність поглинання кисню в 1,5–3,7 рази.
Інтенсивність споживання кисню сперміями за умов ”окисного навантаження” та наявності антиоксидантів у спермі бугаїв. Вивченням шляхів реалізації впливу антиоксидантів на окисно-відновні процеси в сперміях виявлено, що окиснення SH-груп глутатіону т-БГП, гальмує дихальну і відновну активності статевих клітин, відповідно, на 42,5 і 53,1%.
Це дає підстави стверджувати, що SH-групи глутатіону відіграють важливу роль в енергозабезпеченні сперміїв, їх здатності виживати у зовнішньому середовищі, а ”окисне навантаження”, що виникає в процесі технологічної підготовки еякулятів до заморожування та при розморожуванні знижує інтенсивність обмінних процесів та запліднюючу здатність сперміїв. На фоні дії т-БГП та інгібіторів гліколізу, НАД-залежної і термінальної ланки знижуються, відповідно: споживання кисню – на 15,8%, 16,6% і 28,8%, відновна активність – втричі тана 32,1% і 3,0%. При поєднанні Г-SH+т-БГП і блокуванні гліколізу та НАД-залежної ділянки дихального ланцюга споживання кисню і відновна активність сперміїв вищі, відповідно, на 53,2%, 55,4% і 46,4% та у 10 разів, порівняно з величинами значень при дії т-БГП. З пригніченням термінальної ділянки (ЦХО) дихальна активність залишається вищою на 52,7%, а відновна – не змінюється (0,3±0,03 мкг К3…/0,1 мл/хв). Аналогічно, споживання кисню сперміями за поєднання АА+т-БГП, після інгібування гліколізу, НАД-залежної і кінцевої ланок дихального ланцюга, вища на 85,1% та у 15 і 34 рази порівняно Г-SH+т-БГП і на 93,3% та у 30 і 60 разів – з т-БГП. Відновна активність також вища, відповідно, на 76,2, 87,1 і 99,0% ніж при поєднанні Г-SH + т-БГП і 87,3–99,0% – за наявності т-БГП.
Подібна закономірність виявлена при аналізі стану електрон-транспортних ланок дихального ланцюга під впливом інгібіторів і присутності субстратів, антиоксидантів та т-БГП. Спермії бугаїв проявляють різну дихальну та відновну активності і визначають цю різницю субстрати й можливі шляхи їх перетворення, здатність акцепторів приймати та передавати електрони вздовж ланцюга дихання або постачати на зовнішньоклітинні акцептори (рис. 7). У повнокомпонентному середовищі (ЛЖГ) з антиоксидантами та т-БГП, змінюються можливості використання альтернативними метаболічними шляхами різних за біохімічними характеристиками сполук, оскільки спермії для забезпечення енергетичних потреб окиснюють більш енергоємкі субстрати (жовток), що призводить до зростання азидрезистентного (немітохондріального) окиснення.
Ефективність використання антиоксидантів у складі розріджувача для заморожування сперми бугаїв. Різні дози АА і Г-SH в розріджувачі виявляють вплив на виживання сперміїв і активність ферментів розмороженої сперми (табл. 3). Однак, якщо максимальний вміст Г-SH (5,00 мМ) в ЛЖГ-середовищі знижує виживання сперміїв на 40 хв (р>0,05), то підвищення дози АА з 1,25 до2,50 та 5,00 мМ зумовлює зниження величини названого показника, відповідно, на 25,0, 115,0 та 235,0 хв (р<0,001). При цьому, збільшення дози Г-SH стимулює активність СДГ, відповідно, в 3,1, 12,8 та 24,3 рази. Активність ЦХО знижується, відповідно, на 36,0%, 52,9% та 85,4%. Аскорбінова кислота в дозі 1,25 мМ понижує активність СДГ на 13,7%, а при 2,50 та 5,00 мМ підвищує на 22,7% та 100%, відповідно. На активність ЦХО додавання АА в дозах 1,25 та 2,50 мМ виявляє однаковий вплив (13,4–13,8 мкМ/хв/л), а 5,00 мМ – активність підвищує на 90,4%. Поєднання в розріджувачі АА+Г-SH (відношення 1,25:2,50 мМ) знижує активність СДГ на 21,3%, ЦХО на 27,6%, резистентність та виживання сперміїв, відповідно, на 44,0% та 5,5%, підвищує вміст МДА на 22,7%. При цьому, активність сперміїв як у контрольних, так і дослідних пробах не змінюється і становить 3,6 бала.
Таблиця 3
Виживання сперміїв і активність ферментів у розмороженій спермі з антиоксидантами, n = 19; M ± m
| Доза антиокси- данта, мМ | Виживання сперміїв, хв | Активність ферментів у спермі, мкМ/хв/л | |
| СДГ | ЦХО | ||
| Аскорбінова кислота | |||
| Контроль | 495,0 ± 7,07 | 2,2 ± 0,78 | 10,5 ± 0,68 |
| Дослід: 1,25 | 470,0 ± 21,61 | 1,9 ± 1,22 | 13,4 ± 0,70** |
| 2,50 | 380,0 ± 43,25 | 2,7 ± 1,06 | 13,8 ± 1,36 |
| 5,00 | 260,0 ± 16,30*** | 4,4 ± 1,65 | 20,0 ± 2,04*** |
| Відновлена форма глутатіону | |||
| Контроль | 495,0 ± 7,07 | 0,7 ± 0,35 | 14,2 ± 1,80 |
| Дослід: 1,25 | 500,0 ± 8,16 | 2,2 ± 0,78 | 9,1 ± 0,68* |
| 2,50 | 500,0 ± 8,39 | 9,0 ± 1,15*** | 6,7 ± 0,74** |
| 5,00 | 460,0 ± 40,81 | 17,0 ± 2,65*** | 3,5 ± 1,22*** |
Зміна співвідношення АА+Г-SH в сторону зменшення дози першої (0,35 : 2,50 мМ) забезпечує підвищення виживання сперміїв на 30,1% (р<0,001) і активності СДГ на 11,5%, але знижується ЦХО на 36,2%. Значення інших досліджених показників не відрізняються і знаходяться в межах: рухливість сперміїв – 3,8 бали, резистентність 6,4–8,0 тис, вміст МДА 10,2–10,8 нг/мл. Наступне зменшення вмісту АА (відношення АА : Г-SH – 0,25 : 2,50 мМ) не впливає на фізіологічні і біохімічні показники статевих клітин.