Публикации. По материалам диссертации опубликовано 64 печатные работы. Из них 34 статьи: 28 – в отечественных и 6 – в зарубежных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 862 источника (86 отечественных и 776 зарубежных). Диссертация изложена на 300 страницах, включает 33 таблицы и 25 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Фармакологическое воздействие на опиоидную систему путем введения агонистов ОР δ-типа и ингибиторов ферментов деградации опиоидных пептидов оказывает анксиолитическое действие, выраженность которого зависит от исходного состояния организма, определяемого как генотипическими факторами, так и воздействием окружающей среды.
2. Один из механизмов анксиолитического действия пептидного препарата селанка связан с активацией опиоидной системы, в частности, с ингибированием энкефалиндеградирующих ферментов.
3. Выраженный клинический эффект селанка наблюдается при генерализованном тревожном расстройстве, характеризующемся недостатком эндогенных ингибиторов ЭДФ, и сопровождается повышением среднего значения времени полупревращения лей-энкефалина в сыворотке крови больных.
4. Анксиолитическое действие селанка и даларгина на животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений, в том числе, расстройств функций сердечно-сосудистой и иммунной систем.
Материалы и методы
Характеристика клинического материала. В работе всего изучено 225 человек. Из них 74 здоровых добровольца (39 женщин, 35 мужчин, средний возраст 30±2 года), 59 пациентов (29 женщин, 30 мужчин, средний возраст 31±2 года), у которых, в соответствии с критериями DSM‑4, диагносцировались тревожно-фобические расстройства (генерализованное тревожное расстройство, паническое расстройство или агорафобия)[1]. В рамках второй фазы клинических испытаний селанка было обследовано 30 больных, в состоянии которых имелись проявления тревоги. По МКБ‑10 у них было диагностировано ГТР (12 человек), смешанное тревожно-депрессивное расстройство и депрессивный эпизод (по 9 человек)[2]. В клинико-биологическое исследование, проводившееся в рамках третьей фазы клинических испытаний селанка в сравнении с медазепамом, были включены 62 пациента (13 мужч., 49 женщ., средний возраст 38,6±9,1 лет): 30 с генерализованным тревожным расстройством (F41.1) и 32 с неврастенией (F48.0). Продолжительность заболевания у всех пациентов равнялась 14,0±17,9 месяцев, у пациентов, страдающих ГТР и неврастенией – 12,0±10,0 и 15,9±23,0, соответственно[3]. Препарат селанк использовался в виде 0,15% раствора для интраназального применения, его суточная доза (2.7 мг) была разделена на 3 приема. Медазепам использовался в таблетированной лекарственной форме в суточной дозе 30 мг, разделенной на 3 приема.
Критериями, исключающими участие в исследовании как здоровых доноров, так обследованных больных, являлись: возраст старше 50 и моложе 18 лет, наличие в анамнезе острых и хронических заболеваний печени и почек, а также применение гипотензивных препаратов, фармакологическое действие которых основано на ингибировании ангиотензинпревращающего фермента (капотен, энап и т.п.).
Для оценки состояния пациентов использовались следующие методики: шкала оценки выраженности симптоматики,составленная на основе «Унифицированной системы оценки клинико-фармакологического действия психотропных препаратов у больных с пограничными нервно-психическими расстройствами» (Александровский и соавт., 1984), шкала для объективной оценки тревоги Гамильтона (HAMA) (Hamilton, 1959), шкала самооценки тревоги Цунга (ASRS, Zung, 1971), шкала общего клинического впечатления (CGI) (NationalInstituteofMentalHealth, 1976). Степень дисфункции вегетативной нервной системы оценивали по методу А.М. Вейна (1998 г.). Сила и интенсивность панических атак оценивалась по шкале панических атак и приступов тревоги Шихана (Sheehan, Sheehan, 1983).
Психологическое тестирование. Оценку конституционально-личностных характеристик пациентов проводили при помощи Личностного опросника Айзенка (EysenckPersonalityInventory, или EPI) в адаптации И.Н. Гильяшевой (1983), предназначенного для диагностики двух базовых измерений личности: невротизм – эмоциональная стабильность и экстраверсия-интроверсия. Сочетание оценок по этим шкалам позволяет разделить испытуемых на 4 типа темперамента: меланхоликов, холериков, сангвиников и флегматиков. Граничное условие – 12 баллов по обеим шкалам.
Уровень личностной тревожности пациентов определяли по шкале Спилбергера в адаптации Ю. Ханина (1976).
Используемые животные. В эксперименте использовали 574 белых беспородных крысы (517 самцов и 57 самок), 123 крысы-самца популяции Wistar, полученных из питомника РАМН «Столбовая», а также 270 мышей-самцов линии Balb/с, 68 мышей-самцов линии C57Black/6 и 10 белых беспородных крыс-самцов, полученных из питомника «Крюково-Центральное». Животных содержали в стандартных условиях вивария по 10 в клетке МАKIV при температуре 220С, световом режиме 12:12 часов (свет с 8.00 до 20.00), питьевом и пищевом режиме ad libitum. В течение 3 недель до начала эксперимента животные адаптировались к условиям вивария.
Тестирование спонтанной двигательной активности животных. Тестирование спонтанной двигательной активности крыс проводили в течение пяти минут в компьютеризированной системе Auto Track System (ATS) фирмы Columbus Instruments (США), представляющей собой «мягкий вариант» системы «открытое поле»: слабое освещение и размеры камеры (42х42х20 см) близки к обычным условиям содержания животных. Тестирование проводили в соответствии с методикой, разработанной под руководством проф. Г.Г. Барсегяна (Кордзадзе и соавт. 1992).
При проведении всех фармакологических исследований животных разбивали на экспериментальные группы, гомогенные по параметру «горизонтальная двигательная активность в ATS» (ГДА). При статистическом анализе полученных данных, в зависимости от величины выборки экспериментальных животных, было использовано два критерия ранжирования крыс по ГДА. В случае относительно маленьких выборок использованных в эксперименте животных, исходя из значений медианы ГДА, выделялось две группы: высоко- и низкоактивных. При достаточно больших выборках животных разбивали на три группы по методу, описанному Р.Н. Кордзадзе и соавторами (1992). Критериями отбора служили точки перегиба на кривой нормального распределения, описывающей ГДА данной выборки крыс. Крысы, значения ГДА которых располагались на кривой до первой точки перегиба, считались «низкоактивными», после второй точки перегиба – «высокоактивными», а животные с двигательной активностью, укладывающейся в среднюю часть кривой – «средними».
Тестирование двигательной активности большой выборки (около 2000) животных, проведенное в НЦ ПЗ РАМН в нашей лаборатории и в лаборатории проф. Г.Г. Барсегяна за несколько лет, показало, что для крыс популяции Wistar, полученных из питомника Столбовая, точки перегиба на кривой нормального распределения соответствовали ГДА около 1100 и 1600, а для белых беспородных крыс из питомника Крюково – 1086 и 1860 см/5 мин.
Спонтанную двигательную активность мышей оценивали в течение 5 мин в аналогичной ATSавтоматизированной системе Rat-o-Matic(Columbus Instruments, США), регистрирующей горизонтальное перемещение (аналог ГДА), количество стоек и встряхиваний животного.
Обучение и тестирование крыс в «челночной камере». Обучение крыс в «челночной камере» проводили с использованием экспериментальной компьютеризированной установки «Reflex‑16» фирмы «Columbus Instr» (США) по схеме, описанной в статье А.А. Зозуля и соавт. (1996). К избравшим активную стратегию избегания относились животные, преимущественно (>70% предъявлений) реагировавшие на условный сигнал, животные с пассивной стратегией реагировали на электрошок или у них наблюдалось отсутствие перехода (>70% предъявлений).
В эксперименте по изучению влияния даларгина на иммунный статус и поведение крыс в «челночной камере» через день после окончания обучения животным проводили пятидневный курс введения даларгина. Даларгин вводили внутрибрюшинно по 20 мкг/кг один раз в день. Контрольным животным в том же объеме вводили физиологический раствор. На следующий день после последнего укола крыс тестировали в «челночных камерах» и через 2 часа после тестирования забивали.
Конфликтный тест Вогеля проводился в анксиометре фирмы «Columbus Instr» (США), как описано в статье А.А. Зозуля и соавт. (1999).
Тест «открытое поле»(ОП) проводили по стандартной методике (Середенин С.Б. и соавт., 1998).
Тестирование животных в установке «приподнятый крестообразный лабиринт»(ПКЛ) проводили по стандартной методике в течение 5 мин. Установка для тестирования крыс была приподнята на высоту 50 см и состояла из двух открытых (45х10 см), двух закрытых рукавов (45х10х40 см) с открытой крышей и центрального квадрата (в месте соединения) со стороной 10 см. Мышей тестировали в подобной установке с размерами рукавов 23х4.5 см и высотой стенок закрытого рукава 17.5 см.