При изучении анксиолитических эффектов опиоидных пептидов на крыс на следующий день после тестирования в АТS часть животных лишали питья при пищевом режиме adlibitum. Одновременно начинали курс введения (5 дней, 1 раз в день) даларгина или ДАГО (20 мкг/кг внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора), крысам контрольной группы – физиологический раствор. Налоксон (10 мг/кг внутрибрюшинно) в соответствующем эксперименте вводили одновременно с даларгином. При исследовании центрального эффекта даларгина за день до инъекции крысам под легким эфирным наркозом и новокаиновой блокадой сверлили отверстие в крыше черепа и на сутки помещали в одиночные клетки при питьевом и пищевом режиме adlibitum. Препарат вводили однократно в четвертый желудочек мозга в дозах 0,05; 1,00 и 20,00 мкг/кг в 5 мкл. BNTX и налтрибен (0.5 и 10 мкг/кг) вводили одновременно с даларгином (0.05 мкг/кг).
Тестирование влияния селанка на поведение мышей Balb/c в ПКЛ проводили без дополнительных стрессорных воздействий через 30 минут после внутрибрюшинного введения в объеме 0.2 мл физиологического раствора, селанка (600 мкг/кг), налоксона (10 мг/кг) и смеси селанка с налоксоном в тех же дозах.
Определение частоты сердечных сокращений (ЧСС). Для измерения ЧСС животным подкожно вводили микроэлектроды в районе ушей, помещали в стандартную клетку при стандартном освещении и подключали к полиграфу «Мингограф‑7» (ФРГ). ЧСС определяли по количеству R-R интервалов за 10 сек с периодичностью в 30 секунд в течение 5 минут.
Пролиферативную активность лимфоцитов крови крыс определяли по включению Н-тимидина в ДНК культивируемых клеток. Для этого кровь разводили в 10 раз средой 199, содержащей 10 мМ ХЕПЕС и 50 мкг/мл гентамицина, 100 мкл разведенной крови смешивали со 100 мкл обогащенной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамин неспецифический Т-клеточный митоген КонА (в диапазоне концентраций от 0 до 25 мкг/мл). Культивирование проводили при 37оС в течение 96 часов. За 20 часов до окончания инкубации в пробы добавляли по 2 мкКи Н-тимидина. Разделение включенного в ДНК и свободного 3Н-тимидина проводили фильтрацией на стекловолокнистых фильтрах GF/C с помощью клеточного харвестера. Радиоактивность определяли на счетчике MiniBeta.
Мембранную фракцию головного мозга крыс, используемую в радиорецепторном анализе (РРА), получали модифицированным методом Simantovetal. (1976). Для получения Р2 мембранной фракции, использованной при определении активности мембраносвязанных энкефалиндеградирующих ферментов, мозг животных гомогенизировали в охлажденном 50мМ Трис-НСI буфере рН 7,7, содержащем 20% сахарозы, (соотношение вес/объем =1/20) в гомогенизаторе Potter (стекло / тефлон). Гомогенат центрифугировали при 1000 g 20 мин, 4оС. Полученный супернатант повторно центрифугировали (30000g, 30 минут, 4оС), осадок ресуспендировали в том же объеме 50мМ Трис-НСI буфера рН 7,7 и снова осаждали (30000g, 30 минут, 4оС).
Вытесняющую активность лигандов ОР определяли в плазме крови и гиппокампе крыс. При взятии крови качестве антикоагулянта использовали 3% раствор Na2ЭДТА (в соотношении 1:10) с добавлением бацитрацин (200 мкг/мл крови). Кровь центрифугировали при 1000g 10 мин, 40С. Плазму замораживали и хранили при -400С. Гиппокампы выделяли на холоду, замораживали в жидком азоте и хранили при -400С.
Экстракцию опиоидов проводили 0,25 М уксусной кислотой (15 мин., 1000С, 1:10). Раствор замораживали, пробы лиофилизировали и хранили при -400С. Непосредственно перед тестированием образцы растворяли в 50 мМ трис-НСl буфере (рН 7.7), центрифугировали при 8000g 15 мин., в супернатантах определяли вытесняющую активность лигандов ОР мю- и дельта-типов радиорецепторным методом.
Радиорецепторный анализ проводили, как описано ранее (Зозуля А.А. и соавт., 1994).Инкубационная смесь объемом 300 мкл содержала 50мМ Трис-HCI буфер рH 7,7 (20оC)3Н-ДАДЛЭ (0,5–4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 42 Ки/ммоль) или 3Н-ДАГО (4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 40 Ки/ммоль), 1,0–1,5 мг/мл белка мембран головного мозга крыс, 50 мкг/мл ингибитора протеаз бацитрацина. Величину специфического связывания определяли по разности связывания меченого лиганда в отсутствии и присутствии избытка (2мкМ) соответствующих холодных лигандов. Она составляла в 65–85% от общей величины связывания. В случае определения вытесняющей активности эндогенных опиоидов в плазме крови и гиппокампе крыс в инкубационную среду добавляли экстракты этих тканей в трех разведениях, а параллельно строили калибровочные кривые вытеснения 3Н-ДАДЛЭ (4,0 нМ) и 3Н-ДАГО соответствующими холодными лигандами и лей-энкефалином. Активность эндогенных опиоидов в экстрактах оценивали сопоставлением полученных результатов с калибровочной кривой и выражали в моль-эквивалентах.
Равновесные константы связывания (константа диссоциации (Кд) и максимальное число мест связывания (Вмах)) Н-ДАДЛЭ с ОР обонятельных луковиц и стриатума крыс определяли путем линеаризации кривых насыщения в координатах Скэтчарда.
Определение активности энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) проводилось invitroв плазме и сыворотке крови животных и человека и в мозге животных. В этих тканях гидролиз энкефалина происходит по всем пептидным связям и катализируется целым рядом ферментов. Для оценки суммарной активности ЭДФ в тканях определяли: при насыщающих концентрации субстрата максимальную скорость реакции (Vmax, по кривой Михаэлиса-Ментен), являющуюся суммой активностей всех ЭДФ, и при малых концентрациях субстрата – время полупревращения энкефалина (τ1/2), отражающее реальную скорость гидролиза этого пептида в биологических объектах.
При определении τ1/2 лей-энкефалина инкубационная смесь (конечный объем 50 мкл) содержала 10‑кратно разведенную плазму или сыворотку крови, 25 мМ трис-HCl (pH=7,5), 0,15М NaCl, 1 мкКи (150 нМ) равномерно меченного тритием [G3Н] – лей-энкефалина с удельной активностью 120 Ки/моль. Инкубацию проводили при температуре 37°С и останавливали добавлением 5 мкл 0,2 М НСl. Vmax определяли при добавлении 1.5 мМ холодного лей-энкефалина в инкубационную среду. При определении активности ЭДФ мозга инкубационная смесь содержала Р2‑мембранную фракцию мозга крысы или фракции гомогената мозга мышей в концентрации по белку 0.05 – 3.0 мг/мл. Продукты гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в двух системах: этилацетат: изопропанол:вода: уксусная кислота 40:40:1:19 (для силикагельных пластинок Merck, Германия и SILICAGEL 6061, EASTMAN, KodakCompany, США) и 2‑бутанон: трет-бутанол: аммиак:вода 2:2,4:1:1 (для Silufol, Чехия).
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина и [G3Н] – селанка. Для более четкого разделения всех возможных фрагментов [G3Н] – лей-энкефалина, образующихся в результате его ферментативного гидролиза, а также для анализа путей биодеградации селанка была использована ВЭЖХ по методу (Золотарев и соавт., 2006). Экстракцию пептидных фрагментов из биологических образцов проводили 4‑х кратным объемом ацетонитрила с дальнейшим переводом экстракта в 0.1% водный раствор трифторуксусной кислоты.
Методика определения содержания меченого пептида и его метаболитов основана на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ-детекции (спектрофотометр Beckman 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм). Хроматографию продуктов гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина проводили на колонке «Kromasil С18» (4х150 мм) в смеси элюента А (5% ацетонитрил, содержащий 0.05% ТФУ и 0.05% гептафтормасляной кислоты) и элюента В (30% ацетонитрил в элюенте А). Использовали градиент В в А: от 0 до 10% (0–10 мин), от 10% до 50% за 12 мин, от 50% до 100% элюэнта В за 40 мин, – при скорости потока 1 мл/мин. Для хроматографии [G3Н] – селанка и его пептидных фрагментов использовали градиентное элюирование ацетонитрилом 15–35%, содержащим 0.1% гептафтормасляной кислоты, в течение 20 мин на той же колонке.
Концентрацию пептидов определяли по радиоактивности соответствующей фракции с учетом молярной радиоактивности данного фрагмента, которая была рассчитана по данным распределения тритиевой метки в исходном [G3H] – пептиде, полученным с помощью тритиевого ЯМР (Zolotarevetal., 2002).
Определение содержания белка в пробах проводили по методу M.M. Bradford (1976) с использованием наборов фирмы «Bio-Rad» (США). Для определения концентрации мембраносвязанного белка проводилась предварительная обработка мембран лизирующим буфером, содержащим 10 мМ Трис-НСl рН 7.4, 150 мМ NaCl, 1мМ ЭДТА, 0.1% додецилсульфат натрия, 1% Тритон Х‑100, 1% дезоксихолат натрия.
Общий кортизол в сыворотке крови определяли иммуно-ферментным методом с помощью наборов фирмы «DRG» (ФРГ).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «Statgraphics» и «Statistica» для Windows. Достоверность отличия результатов между группами оценивали с помощью критерия Стъюдента. Кроме того, были использованы методы корреляционного анализа для параметрических данных – по Пирсону (r), для непараметричеких – по Спирману (R).
Результаты и обсуждение
Влияние агонистов ОР на поведенческие проявления тревожности животных.
В качестве препаратов, воздействующих на опиоидную систему, в данном исследовании были использованы два пептидных соединения, созданных в нашей стране. Синтетический аналог лей-энкефалина, даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg), разработанный в Кардиологическом научном центре РАМН (Титов и соавт., 1985), является агонистом ОР преимущественно δ-типа. Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro), синтезированный в ИМГ РАН (Пономарёва-Степная и соавт., 1984), – новый препарат с анксиолитическими свойствами, изученными в Институте фармакологии РАМН (Середенин и соавт., 1996).