Таблица 3. Константы связывания 3Н-ДАДЛЭ с центральными ОР у крыс с высокой (ВА) и низкой (НА) исходной двигательной активностью в ATS
| группы животных | Обонятельные луковицы | Стриатум | |||
| Кд (нМ) | Вмах (фмоль/мг белка) | Кд (нМ) | Вмах (фмоль/мг белка) | ||
| интактные | все | 2.9±0.2 (14) | 182±22 (14) | 2.4±0.2 (12) | 96±10 * (12) |
| ВА | 2.6±0.2 (8) | 179±33 (8) | 2.9±0.1## (7) | 114±27#* (7) | |
| НА | 3.0±0.3 (6) | 185±12 (6) | 2.0±0.3* (5) | 63±12** (5) | |
| стресс | все | 2.9±0.4 (9) | 170±27 (9) | 2.7±0.1 (14) | 100±7 (14) |
| ВА | 2.1±0.5## (4) | 152±14 (4) | 3.0±0.1#* (6) | 105±16 (6) | |
| НА | 3.8±0.3 (5) | 226±54 (5) | 2.4±0.2* (8) | 94±8* (8) | |
* – p<0.05, ** – p<0.01 – отличие констант связывания в различных отделах мозга,
# – p<0.05, ## – p<0.01 – отличие констант связывания ОР у НА и ВА животных
Приведены средние значения ± ошибка среднего.
По литературным данным сродство ДАДЛЭ к δ-ОР в 2 раза выше, чем к μ-ОР (Kd=1.5 и 3.2 нМ, соответственно, при тестировании методом вытеснения селективных лигандов из δ- и μ-ОР мозга крысы, Leslie, 1987). То же соотношение Кд при несколько других абсолютных значениях получено на трансгенных клетках, стабильно экспрессирующих эти рецепторы (Minami, Saton, 1995, Georgeetal., 2000). Судя по значениям Кд, полученным в нашем исследовании (табл. 3), в стриатуме ВА крыс доминируют μ-ОР, а у НА δ-ОР вносят свой вклад в соотношение ОР. Полученные данные соответствуют представлению о том, что ОР стриатума принимают участие в регуляции локомоторной активности путем воздействия на дофаминергическую трансмиссию (Jangetal., 2001, Schadetal., 2002). Причем как на фармакологическом, так и на молекулярно-генетическом уровнях показано, что активация μ-, но не δ-ОР приводит к повышению локомоции (Jangetal., 2001, Gaveriaux-Ruff, Kieffer, 2002).
Анализ взаимосвязи состояния центральных ОР с уровнем тревожности в ПКЛ показал, что до стресса водной депривации у менее тревожных крыс (количество выходов в открытые рукава ПКЛ больше, чем среднее по выборке, >2), по сравнению с более тревожными, повышена плотность ОР как в стриатуме, так и в обонятельных луковицах (табл. 4). Это косвенно свидетельствует о том, что в норме ОР δ- и μ-типов опосредуют «противотревожные» функции эндогенных опиоидов.
Таблица 4. Константы связывания 3Н-ДАДЛЭ с центральными ОР крыс с различным уровнем тревожности в ПКЛ
| Число выходов в откр. рукава | Обонятельные луковицы | Стриатум | |||
| Кд(нМ) | Вмах(фмоль/мг белка) | Кд(нМ) | Вмах (фмоль/мг белка) | ||
| ин-такт-ные | 0 | 2.6±0.3 (3) | 180±6## (3) | 2.3±0.3 (3) | 67±12#** (3) |
| 1–2 | 2.6±0.1# (6) | 178±28 (6) | 2.4±0.3 (4) | 81±9#* (4) | |
| 3–5 | 3.6±0.4 (3) | 261±15 (3) | 2.6±0.2 (4) | 132±12* (4) | |
| стресс | 0 | 3.8±0.1# (4) | 203±49 (4) | 2.5±0.5* (4) | 88±15* (4) |
| 1–2 | 2.6±0.5 (5) | 147±16 (5) | 2.7±0.5 (10) | 103±27 (10) | |
* – p<0.05, ** – p<0.01 – отличие констант связывания в различных отделах мозга,
#,## – p<0.05, 0.01 – отличие от низкотревожных (по соответствующей группе) животных
Приведены средние значения ± ошибка среднего.
В результате использованного типа стрессорного воздействия происходит выраженное увеличение тревожности крыс, на фоне которого, как показано нами ранее, проявляется анксиолитический эффект даларгина, при этом на интактных животных препарат не влияет (табл. 1). По-видимому, длительный выброс эндогенных опиоидов в результате хронического стресса приводит к истощению их запасов. Даларгин в этих условиях оказывает анксиолитическое действие по компенсаторному механизму.
С другой стороны, известно, что в результате длительного контакта с агонистами может происходить десенситизация рецепторов. В частности, выброс эндогенных опиоидов при хроническом стрессе приводит к десенситизации ОР, причем δ-ОР более подвержены этому процессу, чем μ-ОР (Gaudriaultetal., 1997, Kim etal., 2003, Narita etal., 2006). В нашем исследовании радиолигандный анализ не выявил существенных изменений констант связывания 3Н-ДАДЛЭ в стриатуме крыс в результате стресса. В то же время Кд этого лиганда с ОР обонятельных луковиц у НА крыс значительно возросла и стала почти в 2 раза выше, чем у ВА крыс (табл. 4). Эта разница примерно соответствует литературным данным о соотношении аффинности ДАДЛЭ к μ- и δ-ОР (Leslie, 1987, Minami, Satoh1995, Georgeetal., 2000). То есть можно предположить, что в обонятельных луковицах ВА крыс доминируют δ-ОР, а у НА животных в этом отделе мозга в результате стресса произошла десенситизация этих рецепторов и доминируют μ-ОР. Обонятельные луковицы играют существенную роль как в исследовательской активности грызунов, так и в формировании тревоги и депрессии, что подтверждено в экспериментах с бульбектомией (Song, Leonard, 2005). Исследовательская активность является, одним из главных факторов, определяющих поведение животных в тесте ПКЛ. Десенситизация δ-ОР в обонятельных луковицах НА, но не ВА крыс (табл. 4), по-видимому, является одной из причин того, что даларгин, более селективный лиганд δ-ОР, чем μ-ОР, оказывает анксиолитическое действие только на ВА животных (табл. 1).
Известно также, ДАДЛЭ обладает более высокой аффинностью к δ1‑ОР, чем к δ2‑ОР (Minami, Satoh, 1995). Поэтому низкую аффинность ОР обонятельных луковиц НА крыс можно объяснить доминированием там δ-ОР второго типа. Фармакологические данные, полученные в данном исследовании подтверждают это предположение: анксиолитический эффект даларгина при центральном введении у ВА крыс блокируется антагонистами обоих подтипов δ-ОР, а у НА крыс – налтрибен, селективный антагонист δ2‑ОР, не блокирует анксиолитическое действие даларгина (табл. 2). Из литературных данных следует, что роль δ2‑ОР в противотревожном действии эндогенные опиоидов более существенна, чем δ1‑ОР, поскольку налтрибен, но не BNTX оказывает анксиогенное действие на животных (Saitohetal., 2005). Схожесть некоторых функций δ2- и μ-ОР может быть следствием того, что свойствами δ2‑ОР обладает гетеродимер μ- и δ-ОР, связанных между собой внутриклеточными С-концевыми участками (Fanetal., 2005). В зависимости от активности синтеза отдельных рецепторных белков в различных органах и, возможно, отделах мозга варьируют формы олигомеризации ОР (Georgeetal., 2000), что также может являться причиной вариабельности биологических эффект опиоидов, в частности, их участия в регуляции тревожности.
Как упоминалось ранее, в тесте Вогеля анксиолитическое действие даларгина более выражено у НА крыс. В этом тесте оценивается способность животных преодолевать конфликт между питьевой мотивацией и болевым раздражением, сопровождающим лизание поилки. Поэтому поведение животных в тесте Вогеля в значительной степени зависит от их болевой чувствительности, в регуляции которой μ-ОР играют более существенную роль, чем δ-ОР (Gaveriaux-Ruff, Kieffer, 2002). Можно предположить, что μ-ОР доминируют не только в обонятельных луковицах (табл. 4), но и в тех отделах мозга НА крыс, которые отвечают за ноцицепцию. Если это предположение верно, то анксиолитический эффект даларгина на НА крыс в тесте Вогеля можно отчасти объяснить его обезболивающим действием, опосредуемым μ-ОР.
Таким образом, в зависимости от состояния ОР, их соотношения в различных отделах мозга, анксиолитическое действие препаратов, взаимодействующих с этими рецепторами, может по-разному проявляться в разных тестах. Как исходный уровень тревожности, так и возможность воздействия на него экзогенно вводимыми опиоидами зависят от состояния ОР и от содержания эндогенных опиоидов в их микроокружении.
К эндогенным опиоидам, в первую очередь относят опиоидные пептиды, среди которых наиболее распространены и изучены энкефалины. Энкефалины – одни из самых короткоживущих регуляторных пептидов. Период их полураспада исчисляется минутами. Поэтому активность ферментов деградации энкефалинов может играть существенную роль как в поведенческих проявлениях тревожности у животных, так и в предрасположенности и формировании некоторых форм тревожных расстройств у людей. Попытка обнаружить взаимосвязь между активностью ЭДФ в целом мозгу мышей и выраженностью поведенческих проявлений тревожности в нашем исследовании не дала убедительных результатов. Это не удивительно, поскольку существует целый ряд ферментов, участвующих в деградации энкефалинов, и их активность существенно варьирует в различных отделах мозга (Gorenstein, Snyder, 1980). Более подробное исследование активности конкретных ферментов в различных отделах мозга, ответственных за реализацию отдельных поведенческих проявлений тревожности, безусловно, дадут положительные результаты.
Удалось также обнаружить взаимосвязь между поведенческими характеристиками и активностью ЭДФ, а также содержании эндогенных опиоидов в плазме крови животных. Так, разделение крыс на 3 группы в соответствии с исходной двигательной активностью в ATSпродемонстрировало, что в условиях стресса тестирования в «челночной камере» у крыс с высокой двигательной активностью (ВА) содержание лигандов ОР μ-типа в плазме крови достоверно выше, чем у остальных животных. У низкоактивных (НА) крыс обнаружено пониженное содержание лигандов ОР δ-типа (табл. 5).
Таблица 5. Активность лигандов ОР (пмоль-экв. ДАГО или ДАДЛЭ/мл) в плазме крови крыс с различной двигательной активностью в ATS