Опиоидергические механизмы тревожных расстройств (стр. 6 из 11)

Тип лигандов ОР	Двигательная активность животных
Тип лигандов ОР	низкая (n=28)	средняя(n=28)	высокая(n=28)
μ – (3Н-ДАГО)	55,5±3,1 **	57,8±3,0	70,7±4,1
δ – (3Н-ДАДЛЭ)	57.6±2.4**++	76.6±6.1	82.0±5.1

** – p<0.01 – отличие от высокоактивных крыс,

++-p<0.01, +-p<0.05 – отличие от крыс со средней двигательной активностью,

Приведены средние значения ± ошибка среднего.

Обнаружены различия в активности ЭДФ плазмы крови мышей Balb/c и C57black/6 в условиях тестирования их в ОП, эмоционально-стрессовая реакция на которое у мышей этих линий кардинально отличается. Скорость деградации лей-энкефалина (150 нМ) в плазме крови мышей линии Balb/с, проявляющих повышенный уровень тревожности в ОП, составляет 50±6 нМ/мин, что на 30% выше (p<0.05), чем у низкотревожных в этом тесте мышей C57Black/6 (38±5 нМ/мин). Можно предположить, что повышенная скорость гидролиза эндогенных опиоидных пептидов является одной из биологических причин высокой тревожности животных, а фармакологические воздействия, направленные на замедление гидролиза энкефалинов, могут оказывать анксиолитическое действие.

Влияние селанка на опиоидную систему

Новый пептидный препарат селанк, синтезированный в ИМГ РАН, в преклинических испытаниях, проведенных в ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, проявил себя как анксиолитик, обладающий также ноотропным и стресс-протективным действием (Середенин и соавт., 1995, 1996, 1998). Вместе с тем, биологический механизм его действия до конца не изучен. Мы исследовали возможность участия опиоидной системы в механизме анксиолитического эффекта селанка.

Радиорецепторным способом было показано, что селанк и его тетрапептидный фрагмент тафтсин способны вытеснять Н-ДАДЛЭ из ОР головного мозга крыс, но в концентрациях, в 10000 и в 200 раз, соответственно, превышающих концентрацию метки. То есть мало вероятно, что механизм действия селанка опосредован его взаимодействием ОР, обладающими выраженной аффинностью к ДАДЛЭ (δ и μ-ОР).

В то же время, была продемонстрирована способность селанка и его пептидных фрагментов, тафтсина и Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, замедлять скорость гидролиза лей-энкефалина ферментами плазмы крови человека и Р2 мембранной фракции мозга крысы (рис. 2). Способность ингибировать ЭДФ у селанка была более выражена, чем у таких известных ингибиторов энкефалиназ, как N-CMPL, D-PAM, лейпептин и пуромицин, но менее выражена, чем у бацитрацина (рис. 2).

Более подробное исследование с использованием ВЭЖХ продуктов гидролиза [G³H] – лей-энкефалина показало, что в тех условиях, когда селанк в 2 раза снижает активность аминопептидаз (основной группы ферментов, участвующих в деградации энкефалинов), он полностью блокирует гидролиз лей-энкефалина карбокси- и дикарбоксипептидазами (табл. 6). То есть можно предположить, что его сродство к ферментам последних двух групп выше, чем к аминопептидазам.

Рисунок 2. Ингибирующее действие селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека (А) и Р2 мембранной фракции мозга крысы (Б)

При изучении процесса биодеградации [G³H] – селанка в плазме крови крысы invitro обнаружилось, что в первую очередь его гидролиз происходит под действием дикарбоксипептидаз с последовательным отщеплением Gly-Pro, и Arg-Pro с С-конца. По этому же пути происходит гидролиз селанка в присутствии одной из основных дикарбоксипептидаз, участвующих в деградации энкефалинов – АПФ.

Таблица 6. Влияние селанка на активность ЭДФ плазмы крови человека invitro

Группы ЭДФ	фрагменты	Концентрация фрагментов (нМ)
	t гидролиза (мин)	Контроль	селанк 15 мкМ
	t гидролиза (мин)	30	30	90	120
субстрат	YGGFL	167	297	154	146
Амино-	Y	250	127	253	273
пептидазы	GGFL	216	100	202	228
Диамино-	YG	9	4	11	14
пептидазы	GFL	7	0	0	0
Дикарбокси-	YGG	19	1	3	5
пептидазы	FL	38	3	12	17
Карбоксипептидазы	YGGF	30	0	0	0
другие фрагменты	GGF	8	0	0	0
GF	21	0	0	0
F	0	0	16	27

Исходная концентрация 3Н-лей-энкефалина в инкубационной среде – 560 нМ.

Разделение продуктов ферментативного гидролиза проводили методом ВЭЖХ на колонке «Хромасил» 4x150 мм. Элюцию вели в линейном градиенте ацетонитрила в 0.1% ТФУ, скорость элюции 1 мл/мин при комнатной температуре.

Представлены типичные результаты одного из трех независимых экспериментов.

Среди продуктов деградации [G³H] – селанка в плазме крови крысы не обнаружен гексапептид KPRPGP, что свидетельствует о том, что моноаминопептидазы не участвуют в его гидролизе. Таким образом, селанк ингибирует ЭДФ, являясь субстратом для дикарбоксипептидаз, но не для моноаминопептидаз. Субстратами этих пептидаз являются, кроме энкефалинов, ряд других регуляторных пептидов, которые также участвуют в регуляции тревожности. Тем не менее, некоторые поведенческие эффекты селанка обусловлены его воздействием именно на опиоидную систему, о чем свидетельствует способность налоксона блокировать эти эффекты. Так, налоксон блокирует депримирующий эффект селанка на индуцированные апоморфином поведенческие проявления гиперфункции дофаминовой системы в тесте «вертикализации» мышей (Мешавкин и соавт., 2006).

Роль опиоидной системы в реализации анксиолитического действия селанка была подтверждена в экспериментальных исследованиях invivo. На фоне повышенного уровня тревожности, вызванного процедурным стрессом внутрибрюшинного введения препарата, селанк оказывал блокируемое налоксоном анксиолитическое действие на мышей Balb/c в тесте ПКЛ (рис. 3). Причем этот эффект был значительно более выражен у мышей с исходно высокой спонтанной двигательной активностью в системе Rat-o-Matic (рис. 3), аналогично анксиолитическому эффекту даларгина, наблюдавшемуся в ПКЛ лишь у ВА (в ATS) крыс (табл. 1). Отсутствие снижения тревожности НА крыс под действием даларгина мы связывали с недостаточной экспрессией δ-ОР в некоторых отделах их мозга. Возможно, у НА мышей Balb/c наблюдается сходная картина: энкефалины, скорость гидролиза которых замедляет селанк, способны взаимодействовать как с δ-, так и с μ-ОР, оказывая через первые «противо-», а через вторые – «протревожное» действие. У НА мышей налоксон не блокирует, а наоборот, сам оказывает и усиливает анксиолитическое действие селанка (рис. 3), по-видимому, за счет блокады μ-ОР. Снижение тревожности при введении налоксона наблюдается у мышей с нокаут геном δ-ОР (Filliol etal., 2000), а также у высокотревожных мышей 129S2/SvHsd, не чувствительных к бензодиазепинам (Rodgersetal., 2006).

Анализ поведения мышей Balb/c в центральном квадрате ПКЛ, которое, с некоторой долей условности, можно рассматривать как аналог психомоторной активности животных, показал, что помимо анксиолитического селанк может оказывать психостимулирующее действие. Причем этот эффект более выражен у НА мышей и не блокируется, а наоборот усиливается налоксоном, хотя в данном случае сам налоксон не влиял на эту форму поведения животных. По литературным данным, как эндогенные (Gaveriaux-Ruff, Kieffer, 2002), так и экзогенно вводимые опиоиды влияют на локомоторную активность животных (Sandi, 1992, Baamondeetal., 1992, Jangetal., 2001, Schadetal., 2002). То есть психостимулирующий эффект селанка также может быть связан с активацией опиоидной системы.

Рисунок 3. Влияние селанка на время нахождения в «открытых рукавах» ПКЛ мышей Balb/c с высокй (ВА) и низкой (НА) исходной двигательной активностью в системе Rat-o-Matic

Рисунок 4. Влияние селанка на активность ЭДФ плазмы крови мышей Balb/с и C57Black/6, в условиях тестирования в «открытом поле» – эффект селанка, р<0.05

Как было продемонстрировано ранее, активность ЭДФ в плазме крови мышей Balb/с с фенотипом повышенной тревожности в тесте ОП существенно выше, чем у C57Black/6, эмоционально стабильных в этом тесте. При этом показано, что в тесте ОП селанк оказывает анксиолитическое действие на мышей Balb/с, но не C57Black/6 (Середенин и соавт., 1996). Мы воспроизвели вышеупомянутый поведенческий эксперимент, а затем у тех же животных измерили скорость гидролиза Н-лей-энкефалина в плазме крови и гомогенате мозга. Было установлено, что введение селанка (внутрибрюшинно, 100 мкг/кг) параллельно со снижением тревожности достоверно снижает скорость распада энкефалина в плазме крови мышей линии Balb/с. Вместе с тем, препарат не изменяет поведение мышей C57Black/6 и не влияет на активность энкефалиндеградирующих ферментов в плазме их крови (рис. 3). При этом достоверных изменений в активности ЭДФ гомогената мозга при введении селанка, ни у Balb/с, ни у C57Black/6 не наблюдается. Таким образом, можно утверждать, что один из механизмов поведенческих эффектов селанка связан с действием на опиоидную систему, поскольку анксиолитическое действие селанка на мышей Balb/с, регистрируемое в тесте ПКЛ, блокируется антагонистом ОР налоксоном, а анксиолитический эффект препарата на поведение мышей Balb/с, но не C57Black/6 в тесте «открытое поле» сопровождается снижением скорости распада энкефалинов в крови мышей Balb/с, но не C57Black/6.

Учитывая продемонстрированные в данном исследовании (табл. 1, 2) и неоднократно подтвержденные в дальнейшем другими авторами данные о «противотревожной» роли экзогенно вводимых агонистов δ-ОР (Vivian, Miczek, 1998, Saitoh etal., 2005, Perrineetal., 2006) и эндогенных опиоидных пептидов, в частности, энкефалинов (Ragnauth etal., 2001, Bilkei-Gorzo etal., 2004, McNallyetal., 2004, Saitoh etal., 2004, 2005, Narita etal., 2006, Perrineetal., 2006), можно предположить, что высокая скорость гидролиза последних является одной из патогенетических причин повышенной тревожности. В связи с этим нами было проведено исследование активности ЭДФ в плазме крови здоровых людей с различными личностными проявлениями тревожности и больных с разными формами тревожных расстройств.