Опрацювання складу, технології та дослідження вагінальних супозиторіїв противірусної дії з протефлазідом (стр. 3 из 5)
| Назва компонента | Кількість компонентів в основі, (г) | ||||||
| Вітепсол Н-15 | 100,0 | ||||||
| Масло какао | 100,0 | ||||||
| Твердий жир | 100,0 | ||||||
| ПЕО 400 | 20,0 | 5,0 | 10,0 | 30,0 | 30,0 | ||
| ПЕО 1500 | 80,0 | 95,0 | 80,0 | 70,0 | 70,0 | ||
| ПЕО 4000 | 10,0 | ||||||
На вказаних основах були виготовлені супозиторії методом виливання. Супозиторії на гідрофобних основах і основі 7, не відповідали вимогам ДФ України за зовнішнім виглядом (були неоднорідними і крихкими). Для подальших досліджень використовували гідрофільні основи. Із трьох гідрофільних основ за результатами біофармацевтичних досліджень (рис.2,3) як найбільш оптимальну вибрано основу 4 - сплав ПЕО 400 і ПЕО 1500 у співвідношенні 2:8.
Рис.2. Динаміка вивільнення флавоноїдів із супозиторіїв:
супозиторії на основі 4 ; 
супозиторії на основі 5; 
супозиторії на основі 6При вивченні розчинення супозиторіїв з Протефлазідом встановлено, що супозиторії відповідають вимогам тесту розчинення супозиторіїв (за 45 хвилин вивільнялось не менше 75% діючох речовини), і більш повне вивільнення флавоноїдів спостерігалось із супозиторіїв, виготовлених на поліетиленоксидній основі 4 (рис.3).
Рис. 3.Розчинення супозиторіїв з Протефлазідом в залежності від часу:
супозиторії на основі 4; супозиторії на основі 6У результаті проведених досліджень нами запропоновано наступний склад супозиторіїв:
Протефлазіду 0,5 мл
Поліетиленоксидної основи
достатню кількість до одержання супозиторію масою 4,0 г.
Нами розроблена технологія вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом в аптечних та промислових умовах. При опрацюванні технології підбирали оптимальний спосіб введення Протефлазіду в супозиторну основу та контролювали фармако-технологічні властивості одержаних супозиторіїв. Протефлазід вводили в основу різними способами:
1. Зішували з розплавленою поліетиленоксидною основою.
2. Змішували з розплавленим ПЕО 1500, нагрівали протягом 10 хвилин при температурі 40-50°С, додавали ПЕО 400.
3. Нагрівали при температурі 40-50°С до повного видалення етанолу і змішували з розплавленою поліетиленоксидною основою.
За зовнішнім виглядом і кількісним вмістом флавоноїдів відповідали вимогам АНД тільки супозиторії, виготовлені за третім способом.
У процесі розробки технології супозиторіїв було обгрунтовано температурний режим введення Протефлазіду у супозиторії і швидкість перемішування супозиторної маси.
Нами розроблена технологічна схема виробництва супозиторіїв згідно з Настановою 42-01-2003 “Лікарські засоби. Технологічний процес. Документація”, яка наведена на рис. 4.
Таблиця 2
Якісні реакції Протефлазіду і супозиторіїв з Протефлазідом
| Реакціїідентифікації | Об’єкт дослідження | |
| Протефлазід | Супозиторії з Протефлазідом | |
| Флавоноїди1. З алюмінію хлоридом2. Хроматогра-фічний метод на пластинках Silufol | Жовто-зелене забарвленняНа хроматограмі дослід-жуваних розчинів з’явля-ються плями жовтого кольору на рівні плям на хроматограмах розчинів СЗРС рутину і кверцетину. | Жовто-зелене забарвленняНа хроматограмі дослід-жуваних розчинів з’явля-ються плями жовтого кольору на рівні плям на хроматограмах розчинів СЗРС рутину і кверцетину |
| ФенолокислотиХроматографіч-ний метод на хроматографіч-ному папері марки “FiltrakFN-1” | З’являються жовті плями на синьому фоні, сині плями на білому фоні та рожеві плями на блакитному фоні, що свідчить про наявність карбонових кислот | З’являються жовті плями на синьому фоні, сині плями на білому фоні та рожеві плями на блакитному фоні, що свідчить про наявність карбонових кислот |
Кількісний вміст флавоноїдів у перерахунку на рутин визначали розробленим нами спектрофотометричним методом при довжині хвилі л = 405 нм. За даними статистичної обробки результатів кількісного аналізу відносна похибка визначення флавоноїдів не перевищує ± 5,4 %.
При стандартизації вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом вивчали показники якості та незмінність цих показників у процесі зберігання згідно з вимогами ДФ України: опис, однорідність маси, однорідність вмісту, ідентифікація, кількісне визначення, розпадання, розчинення, мікробіологічна чистота. Всі показники відповідають вимогам ДФУ, встановленим для вагінальних супозиторіїв (табл.3).
За допомогою періодичного контролю (з інтервалом у 6 місяців) встановлено незмінність показників якості вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом протягом двох років зберігання.
Таблиця3
Фізико-хімічні показники супозиторіїв з Протефлазідом
| Показники якості | Вимоги АНД | Результати дослідження |
| 1 | 2 | 3 |
| Опис | Вагінальні супозиторії кульковидної форми світло-зеленого кольору без запаху | Вагінальні супози-торії кульковидної форми світло-зелено-го кольору без запаху |
| Середня маса | Від 3,8 до 4,2 | 3,96±0,05 |
| Однорідність маси | ±5% від середньої маси вагінаьного супозиторія, тільки 2 вагінальних супозиторії з 20 можуть вийти за ці межі, але не перевищувати ±10% | Відповідає вимогам ДФУ |
| Однорідність вмісту | Вміст діючих речовин у кожному з 10 вагінальних супозиторіїв повинен бути від 85,0% до 115 %, від вказаного в розділі "Склад на один супозиторій", а відносне стандартне відхилення не повинне перевищувати 6,0%. Вміст діючих речовин у кожному з 30 вагінальних супозиторіїв повинен бути від 75, 0 до 115 %, від вказаного у розділі "Склад на один супозиторій", і тільки в одному з 30 супозиторіїв вміст кожної з діючих речовин може перевищувати ± 15 % від вказаного в розділі "Склад на один су позиторій", але не більше ± 25 %, а відносне стандартне відхилення для 30 супозиторіїв не повинне перевищувати 7,8 % | Відповідає вимогам ДФУ |
| Розпадання | Не більше 60 хвилин | Відповідає вимогам ДФУ |
| Розчинення | Не менше 75% діючої речовини і не більше 115% за 45 хв | Відповідає вимогам ДФУ |
| Ідентифікація | ||
| Флавоноїди | 1. Реакція з алюмінію хлоридом2. Хроматографічний метод | Результат позитивний |
| Карбонові кислоти | Хроматографічний метод | Результат позитивний |
| Кількісне визначення | Флавоноїдів (у перерахунку на рутин) не менше 0,0122% | 0,0129±0,0007% |
| Закінчення табл.3 | ||
| 1 | 2 | 3 |
| Мікробіоло-гічна чистота | У 1 г препарату допускається наявність не більше 100 бактерій і грибів (сумарно). Не допускається наявність ентеробактерій і деяких інших грам-негативних бактерій у 1 г. Не допуска-ється наявність Рseudomonas аеruginosa у 1 г. Не допускається наявність Staphy-lococcusaureusу 1 г | Відповідає вимогам ДФУ |
У четвертому розділі наведені результати імунофармакологічних та біологічних досліджень.
Імунофармакологічні дослідження проводили на кафедрі клінічної лабораторної діагностики ЛНМУ імені Данила Галицького. Консультативну допомогу на всіх етапах проведення цих досліджень надавав д.мед.н., проф. Б.Д.Луцик, за що автор висловлює щиру подяку.
Вивчення впливу Протефлазіду на лімфоцити проводили з тією частиною донорів, які мали лімфоцити з високою проліферативною активністю при культивуванні їх з фітогемаглютиніном (ФГА). Рецепторну характеристику лімфоцитів після БТЛ наведено у табл.4.
Результати досліджень свідчать, що у всіх серіях бласттрансформація лімфоцитів проходить за рахунок Т-хелперів. У процесі БТЛ на клітинах зберігаються маркери до нейтрофілів та до В-лімфоцитів. При порівнянні між апоптозозалежними лімфоцитами (CD 95) у трьох серіях дослідів різниця була істотною, критерій Стьюдента (t=3,7) й істотність різниці (Р < 0,004).
Різниця при порівнянні між В-лімфоцитами (СД-19), нейтрофілами (СД-16), Т-хелперами (СД-4) та Т-супресорами (СД-8) у всіх серіях дослідів не істотна. Протефлазід має виражений імуномодулюючий вплив на лімфоцити людини, знижуючи апоптозозалежність лімфоцитів. У процесі БТЛ з ФГА, Протефлазідом та екстрактом елеутерокока залишаються функціонально активними імунні синапси на лімфоцитах до моноклональних антитіл (СД-16, 19, 95).
Білковий спектр сироватки крові та культуральної рідини після БТЛ досліджували для вивчення можливого впливу Протефлазіду на білки плазми крові. Протефлазід та екстракт елеутерокока, перебуваючи в контакті з лейкоцитами і білками упродовж 3-х днів у застосованих концентраціях, не денатурують білки (зберігаються їх ізоелектрична точка і молекулярна маса, що забезпечує їх електрофоретичне розділення).
Нами вивчено вплив Протефлазіду на В-лімфоцити (при дослідженні invitro) при визначенні імуноглобулінів сироватки крові донорів і культуральної рідини після БТЛ. ФГА, Протефлазід та екстракт елеутерокока, перебуваючи в контакті з лейкоцитами протягом 3-х днів у застосованих концентраціях, не активують В-лімфоцити до продукції імуноглобулінів.
Таблиця 4
Рецепторна характеристика лімфоцитів після реакції БТЛ
| Назва показника | Клітини до БТЛM±mS | (а) кліти-ни з ФГАMa±mSn - 12 | (b) клітинизФГАі Проте-флазі домM b ± mSt (a-b) n - 12 | (c) клітини з ФГА і елеу-терококомMc±mSt(a-c) n - 12 |
| CD-4 маркер хелперів | 32,3 ± 0,9S = 4,8 | 48,5 ± 1,9S = 6,5 | 51,9 ± 1,8S = 6,5t (a-b) = 1,1P> 0,2 | 45,6 ± 1,6S = 5,8t (a-c) = 0,9P> 0,3 |
| CD-8 маркер супресорів | 26,1 ± 0,2S = 3,7 | 15,7 ± 1,6S = 5,5 | 16,4 ± 2,1S = 7,3t (a-b) = -0,45P> 0,6 | 15,6 ± 1,4S = 4,8t (a-c) = 0,05P> 0,9 |
| CD-16 маркернейтрофілів | 19,4 ± 0,9S = 5,1 | 20,6 ± 1,9S = 6,7 | 15,6 ± 2,1S = 7,1t (a-b) = 1,87P> 0,08 | 22,5 ± 1,8S = 6,5t(a-c)=-0,7P> 0,5 |
| CD-19 маркерВ-лімфоцитів | 22,3 ± 0,81S = 4,6 | 26,7 ± 1,6S = 5,6 | 23,2 ± 2,6S = 9,1t (a-b) = 1,2P>0,2 | 23,8 ± 2,2S = 4,4t (a-b) = 0,9P> 0,3 |
| CD-95 маркер апоптозуклітин | 9,7 ± 0,5S = 1,3 | 16,1 ± 1,7S = 5,9 | 9,3 ± 0,5( ***)S = 1,8t (a-b) = 3,7P< 0,004 | 13,4 ± 1,2S = 4,4t(a-c)= 1,54P> 0,1 |
Цитокіни (г-інтерферон та 1b-інтерлейкін) у сироватці крові донорів і культуральних рідинах після бласттрансформації лімфоцитів з ФГА, Протефлазідом та екстрактом елеутерокока вивчали для визначення функціональної активності лімфоцитів. В утворенні г-інтерферону приймають участь Т-хелпери. Більшість клітин людського організму можуть продукувати 1b-інтерлейкін, але для цього вони повинні бути активовані.