Впровадження в практику. Розроблений спосіб диференційної діагностики лімфопроліферативних новоутворень орбіти та придатків ока впроваджений у лабораторії патоморфології та електронної мікроскопії Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України.
Особистий внесок здобувача в розробку наукових результатів. Ідея наукового дослідження належить науковому керівнику, д.мед.н., проф. Віту В.В. Пошукувачем спільно з науковим керівником проведена постановка задач дослідження і визначена методологія роботи. Особисто автором проводився аналіз вітчизняної та іноземної літератури за обраною темою, що дало змогу розробити програму виконання дисертаційної роботи. Проведено аналіз одержаних даних, наукове обґрунтування та інтерпретація здобутих результатів, підготовка їх до публікації. Також автор особисто виконував клінічне обстеження 17 хворих, провів 73 морфологічних та імуногістохімічних досліджень. Цитогенетичне дослідження пошукувач особисто провів 31 пацієнту. Визначення імунофенотипу ЛПН пошукувач виконував спільно із співробітниками відділу механізмів протипухлинної терапії на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України. Статистичний аналіз проводився при консультативній допомозі наукового співробітника Драгомірецької О.І. В наукових роботах, що опубліковані по темі дисертації у співавторстві, головна роль у постановці задач дослідження, аналізі результатів, визначенні їх значимості належить пошукувачу.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати дослідження доповідалися і обговорювалися на науково-практичній конференції молодих вчених України (Харків, 2006); 4-й Міжнародній конференції офтальмологів країн Причорномор’я (Анапа, 2006); ювілейній науково-практичній конференції “Федоровские чтения – 2007” (Москва, 2007), 105 конгресі товариства німецьких офтальмологів (Берлін, 2007), вченій раді Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України (Одеса, 2007)
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових робіт, в тому числі 3 статті в наукових журналах і збірниках наукових праць, рекомендованих ВАК України, 4 - в тезах конференцій, отриман 1 патент України на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація написана українською мовою, викладена на 135 сторінках тексту. Складається з вступу, 6 розділів, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 41 рисунком та 6 таблицями, які займають 4 окремі сторінки. Список використаних літературних джерел містить 203 найменування і займає 22 сторінки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Було досліджено 402 хворих ЛПН орбіти та придатків, віком від 16 до 89 років. Чоловіків було 209 (52%), а жінок – 193 (48%). Серед гістологічного матеріалу, що досліджувався, ЛПН орбіти склали 67% (269 випадків), кон’юнктиви – 26% (104 випадка), повіки – 7% (29 випадків). 246 хворим був встановлений раніше діагноз лімфома, що склало 61%, а 156 пацієнтам – РЛГ (39%).
Клінічна картина у 73 хворих з ЛПН враховувалася за 8 ознаками: стать, вік, локалізація ЛПН, наявність білатерального ураження, проростання тарзоорбітальної фасції, ураження стінки орбіти, ступінь екзофтальму, обмеження рухомості ока. Отримана частина якісних ознак була формалізована.
Морфологічна характеристика пухлин 73 препаратів включала: розмір клітин, особливості розташування ядра, однорідність структури тканин, формування особливих структур, що дало можливість виділити чотири морфологічні групи. При імуногістохімічному дослідженні визначався тип ЛПН (РЛГ, лімфома маргінальної зони (ЛМЗ), ЛЗМ, дифузна В-крупноклітинна лімфома (ДБКЛ), фолікулярна лімфома (ФЛ), лімфоцитарна лімфома (ЛЦЛ), плазмоцитома). З цією метою використовувалася система візуалізації EnVision+ (DAKO), запропонований набір моноклональних антитіл (СD3, CD5, CD20, CD23, Cyclin D1, kappa, lambda (DAKO)), хромоген-субстрат АЕС+ (DAKO).
Цитогенетичне дослідження виконано на 31 гістологічному препараті у випадках діагнозу ЛЗМ або ЛМЗ. Враховувались наступні показники: мітотичний індекс, кількість патологічних, фізіологічних мітозів, а також тих, що важко диференціювати, і кількість мітозів, які знаходяться на початкових стадіях.
На основі клінічних, морфологічних, імуногістохімічних і цитогенетичних показників, які отримані в результаті дослідження хворих, була сформована база даних. Статистичну обробку проводили за допомогою електронного пакету прикладних програм Statistica 6.0 для Windows, MedCalc version 9.0.1.1. (Demo). Застосовувався діагностичний тест на основі цитогенетичного показника мітотичної активності з побудовою ROC-кривої. Остання відображала чутливість від вірогідності хибнопозитивних результатів, тобто специфічності. Інформативність діагностичного тесту визначається тим, наскільки високо лежить його характеристична крива від діагоналі (Власов В.В., 1988; Файнзильберг Л.С., 2003). Для оцінки розбіжностей у двух групах використовувався критерій Ст’юдента з попередньою оцінкою нормальності розподілення за критерієм Колмогорова-Смірнова. При дослідженні груп по якісним показникам проводився аналіз таблиць, що містили розрахунок чі-квадрат статистики Пірсона. Основними статистичними параметрами були: середнє арифметичне значення кожного ряду (М), стандартне відхилення (SD), стандартна помилка (SE), рівень значимості (p), що визначає статистично значимі розбіжності (Власов В.В., 2001; Реброва О.Ю., 2002).
Результати дослідження та їх обговорення
Клінічні прояви лімфопроліферативних новоутворень орбіти і придатків ока та можливість їх використання в діагностиці новоутворень лімфоїдного генезу. Аналіз 402 історій хвороб офтальмоонкологічного відділення Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України з 1982 по 2006 роки виявив, що частота виникнення ЛПН орбіти та придатків ока в останні 5 років зросла у 2,6 разів порівняно із 1982 по 1986 рр.
При визначенні локалізації пухлин з’ясувалося, що переважали пацієнти з новоутвореннями орбіти – 269 осіб (67%), з кон’юнктивальною локалізацією було 104 особи (26%), а на повіках - лише 29 осіб (7%).
При аналізі встановлених діагнозів ЛПН орбіти, кон’юнктиви та повік на основі клінічних і морфологічних даних виявлено, що із 46 новоутворень орбіти правильних діагнозів було встановлено 45 (97,8%), а при локалізації новоутворення у кон’юнктиві та повіках діагноз співпав у 15 (56%) випадках із 27.
Виявлена статистично значима різниця між віком хворих із різними типами ЛПН (РЛГ, лімфомою) (рис. 1).
Середній вік хворих РЛГ на 13,7 років менший у порівнянні із хворими лімфомою. Для проведення диференційної діагностики між РЛГ та лімфомою був застосований ROC-аналіз.
“Точкою перегину” є вік 62 роки. Вище цієї точки специфічність складає 92,9%, а чутливість – 51,9%. Це свідчить про те, що у людини віком більше 62 років з ЛПН, вірогідність наявності РЛГ становить 7,1%. Вік хворого повинен враховуватися тільки в комплексі додаткових даних (орбітальна локалізація, наявність мономорфної гістологічної картини).
Аналіз клінічних ознак ЛПН (екзофтальм, порушення рухомості ока, двобічна локалізація, ураження кісткової стінки) не виявив патогномонічних ознак. Поліморфізм клінічних проявів не дає змогу визначитися із клітинним типом ЛПН. Проведені комп’ютерна томографія (КТ) і магнітно-резонансна томографія (МРТ) встановлюють лише факт наявності новоутворення та його анатомо-топографічне розташування відносно оточуючих тканин. Тому для встановлення кінцевого діагнозу необхідно застосувати морфологічне та імуногістохімічне дослідження.
Морфологічні та імуногістохімічні особливості лімфопроліферативних новоутворень орбіти та придатків ока. Результатом морфологічного дослідження ЛПН (РЛГ і лімфом) орбіти та придатків ока стало виділення чотирьох груп новоутворень за особливостями клітинної структури:
1-а група (60 препаратів) – пухлини із мілких лімфоцитів, ядра яких розташовані центрально. В них відсутні фолікулярні структури, але можлива наявність домішку інших клітин гемопоетичного походження;
2-а група (7 препаратів) – пухлини з великими клітинами, що нагадували центробласти;
3-я група (1 препарат) – пухлина, що складалася виключно з плазмоцитарних клітин, розміри яких більші за нормальний лімфоцит з ексцентрично розташованим ядром, фолікулярні структури відсутні;
4-а група (5 препаратів) – пухлини з мілкими лімфоцитами і поодинокими лімфобластними клітинами, визначалися фолікулярні структури (рис. 2).
Серед 73 ЛПН орбіти та придатків ока переважали новоутворення, що складалися виключно з мілких клітин – 82% (60 препаратів), більшість з останніх мали мономорфну гістологічну будову – 55% (33 препарати). Для визначення цінності морфологічного дослідження було проведено імуногістохімічне дослідження. З цією метою був запропонований та впроваджений оптимальний набір антитіл (kappa, lambda, CD3, CD5, CD20, CD23, Cyclin D1) для визначення типів ЛПН орбіти та придатків ока (Пат. № 26436 Україна МПК G01N 33/53).
Імуногістохімічне дослідження цих груп пухлин орбіти та придатків ока показало, що злоякісні пухлини становили 57 (78%) випадків, а доброякісні - 16 (22%). Тобто лімфоми орбіти та придатків ока зустрічаються у три рази частіше за РЛГ. Серед лімфом цієї локалізації переважають ЛМЗ (69%).
До пухлин першої групи відносились РЛГ, ЛЦЛ, ЛМЗ, ЛЗМ.
РЛГ – мілкоклітинні новоутворення з поліморфною гістологічною структурою, співвідношення kappa:lambda менше, ніж 6:1 та lambda:kappa менше, ніж 4:1. Т-клітин більше 20%, але менше 70%.
ЛМЗ – мілкоклітинна пухлина з мономорфною чи поліморфною гістологічною картиною. Співвідношення kappa:lambda більше, ніж 6:1 та lambda:kappa більше, ніж 4:1. В-лімфоцитів не менше 80%. Мінливий імунофенотип щодо CD5 антигену.